运动性疲劳大鼠谷氨酸、γ-氨基丁酸受体含量变化及中药的调节作用

作者           作者单位

张蓉    中国人民解放军第二炮兵总医院,北京 100088

李峰    北京中医药大学,北京 100029

王莹莹  北京中医药大学,北京 100029

张颖    北京中医药大学,北京 100029

李维    北京中医药大学,北京 100029

孔烈    北京中医药大学,北京 100029

于爽    北京中医药大学,北京 100029

郑硕    北京中医药大学,北京 100029

徐铭谦  北京中医药大学,北京 100029

Study on the Amount of GLU and GABA Receptor in Brain of Sport Fatigue Rat and Regulation of Traditional Chinese Medicine Prescriptions

ZHANG Rong, LI Feng, WANG Ying-ying, et al

(The Second Artillery General Hospital of PLA, Beijing 100088, China;Beijing University of TCM, Beijing 100029, China)

Abstract：Objective To study the amount of GLU and GABA receptor in brain of sport fatigue rat and regulation of traditional Chinese medicine prescriptions. Method Sport fatigue model rats were made with exhaustive swimming. Rats were divided into normal group, model group, three Chinese medicine groups with tonifying speen, soothing liver and reinforcing kidney respectively, 6 rats in each group. The assessment was made through watching cell number of brain tissue smear by means of immunity differentiation. Result Hippocampus GLU receptor content showed a declining tendency in the model group compared with other groups, while GABA receptor content showed increasing tendency. In corpora striatum model, NR1 and NR2 receptor raised compared with other groups, while GABA receptor increased, soothing liver and tonifying spleen traditional Chinese medicine prescriptions had a better moderating effect. Conclusion GLU and GABA receptor content of sports fatigue rats can be adjusted through soothing liver and tonifying spleen.

Key words：sports fatigue;GLU;GABA;TCM therapy;rats

谷氨酸(GLU)/γ-氨基丁酸(GABA)是重要的学习记忆调节系统。GLU与GABA的动态变化和平衡对于学习记忆起着重要的调节作用。运动过程中,GLU与GABA的比值出现了一定的变化,但是其对于学习记忆的影响还要通过受体来介导。而运动性疲劳过程中二者受体水平的相关报道并不多见。因此,运动性疲劳是否导致了GLU及GABA受体的变化,进而影响了学习记忆能力,中药对其治疗作用如何,需要我们从实验中进行验证。

1 材料与方法

1.1 动物

Spargue-Dawley雄性健康大鼠,体重180～200 g,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号：SCXK(京)2005-0002。

1.2 试剂及仪器

脱色摇床(TS-1型)：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司;光学显微镜：Nikon自动显微镜照相系统;电热恒温培养箱(DH3600AB型)：天津市泰斯特仪器有限公司;电热三用水浴箱(BDS1型)：北京市医疗设备厂;恒温冷冻切片机：CM1900 Leica,Germany;精密电子天平(JJ5000型)：美国双杰兄弟(集团)有限公司。

NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B免疫组化试剂盒：武汉博士德公司;GABAARα1免疫组化试剂盒：CHEMICON公司;PBS、3-3二氨基联苯胺(DAB)：北京中山生物技术有限公司;Tween-20：Sigma;TritonX-100：Amresco;Tris：Japan;多聚甲醛、蔗糖、戊巴比妥钠：北京化学试剂公司;抗体稀释液：北京中杉金桥生物技术有限公司;兔SP kit、正常山羊血清(工作液)：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 分组

实验大鼠随机分成5组：正常对照组、模型组、疏肝方中药组、健脾方中药组、补肾方中药组,每组6只。

1.4 造模

参照文献[1]方法,除正常对照组外,其余4组大鼠先进行3 d的适应性游泳,每日1次,每次20 min,随后开始10 d的正式游泳训练。泳池规格为100 cm×70 cm×80 cm,水温(30±2)℃。游泳训练第1-7日,每日上午9点进行1次游泳运动,时间为3 h;第8-10日每日游泳2次,每次3 h,第1次在上午9点,第2次在下午6点进行,2次间隔6 h。

1.5 给药

本实验所用中药为深圳三九中药配方颗粒。疏肝、健脾、补肾中药各组在训练期间于训练后1 h灌胃配方3 mL,其余各组灌胃等体积的蒸馏水。疏肝中药组应用四逆散,健脾中药组应用四君子汤,补肾中药组应用肾气丸。上药按人体用药量换算为大鼠等效剂量作为大鼠用药量,为12 g/kg左右,250 g大鼠应给药3 g。

1.6 标本的采集与制备

训练结束后,大鼠经10%水合氯醛(400 mg/kg体重)麻醉后,剖开胸腔,经左心室向升主动脉插管,以预冷的生理盐水快速灌冲洗,约100～200 mL,直至流出的液体变清为止。继之灌入预冷的多聚甲醛(0.1 mol/L PB配置,pH 7.4)300 mL,约30 min;开颅取脑,40 g/L多聚甲醛固定10 h,然后将脑组织置于25 g/L蔗糖中(浸0.1 mol/L PB配置,pH 7.4)4 ℃保存,待组织下沉后于-20 ℃恒冷切片机切片,切片厚15 ?m,裱贴在预先经2%APES胶处理过的载玻片上,固定干燥备用。

1.7 免疫组化染色程序

冰冻切片常温下恢复20 min,用0.01 mol/L PBS水洗3×5 min;加入配好的3%过氧化氢溶液孵育10 min,以消除内源性过氧化物酶的影响;蒸馏水冲洗3×5 min,0.01 mol/L PBS水洗3×5 min;滴加10%的正常山羊血清工作液封闭,室温孵育60 min,吸出封闭血清;加入用抗体稀释液稀释的一抗(NMDAR1稀释度为1∶100,NMDA2A稀释度为1∶200,NMDAR2B稀释度为1∶200,GABAARα1稀释度为1∶50),室温孵育1 h, 4 ℃孵育36 h;用PBS冲洗3×5 min;加入生物素化的羊抗兔(稀释度为1∶200,用1%BSA-PBS稀释)室温孵育4 h;PBS冲洗3×5 min;加入HRP标记的链霉卵白素(1∶200,用1%BSA- PBS稀释)室温孵育2 h;PBS冲洗3×5 min;每张切片滴加100 ?L DAB,显微镜下控制显色,以反应物呈棕黄色、背景为淡黄色为度。冲洗后常规脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。阴性对照组分别以正常兔血清和0.01 mol/L的PBS代替一抗,其他步骤与上述相同。在对照实验中没有发现阳性物出现,即无特异性反应。

1.8 图像处理

Nikon显微镜、数码相机,Image-pro Plus Version5.1进行图像采集和处理。对上述免疫阳性物进行定量检测。每组随机测试5张切片,每一部位随机测试2个视野;分别测量阳性细胞数、平均光密度(mean optical density,MOD)、积分光密度(integraloptical density,IOD)。用光密度表示受体的相对含量,IOD结合阳性细胞面积和MOD两方面因素,可用IOD表示受体的相对含量。

1.9 统计学方法

结果均采用SPSS12.0统计软件分析,所用数据用—(—数)±s表示,组间差异采用方差分析(ANOVA)方法,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果(见表1～表6)

表1 各组大鼠海马CA1区NR1免疫阳性反应物比较(略)

表2 各组大鼠纹状体NR1免疫阳性反应物比较(略)

表3 各组大鼠海马CA1区NR2A免疫阳性反应物比较(略)

表4 各组大鼠纹状体NR2A免疫阳性反应物比较(略)

表5 各组大鼠海马CA1区GABAARα1免疫阳性反应物比较(略)

表6 各组大鼠纹状体GABAARα1免疫阳性反应物比较(略)

3.1 谷氨酸/γ-氨基丁酸调节系统的研究意义

学习记忆调节系统是继胆碱能神经之后神经递质调控学习记忆功能的又一种理论。该理论认为,GLU对学习记忆起正性调节作用,GABA对学习记忆起负性调节作用[2]。

海马是内侧颞叶系统中与学习记忆最密切相关的结构,是再记忆的结构基础,参与了陈述性记忆的过程。海马内存在两种形式的长时程增强(LTP),一种是依赖于NMDA受体产生的,主要在海马CA1区的舍费尔旁路突触;另一种是不依赖于NMDA受体产生的,主要存在于海马CA3区的苔藓纤维突触。依赖于该受体的LTP的产生和维持,均与NMDA受体的激活密切相关。因此,本研究选择依赖于NMDA受体的CA1区作为研究部位。实验结果表明,模型组大鼠海马的NR1、NR2A蛋白与正常组比较都呈下降趋势,而GABAARα1含量表达呈上升趋势。分析其原因,我们认为与长时间大量运动造成脑组织缺血、缺氧,进而导致脑神经元损伤有关。运动过程中,兴奋性神经递质GLU大量释放,导致了神经毒性作用,通过激动NMDA受体,直接或间接启动电压依赖性通道,Ca2+大量内流,造成迟发性的神经元变性坏死的迟发过程,该过程为不可逆。实验结果显示,海马CA1区NMDA阳性细胞数明显减少。因此推测,运动性疲劳时,由于兴奋性氨基酸递质释放增加,导致了对神经元的损伤,进而导致了NMDA受体含量下降。此外,由于脑血流下降,能量耗竭,Na+-K+-ATP酶受到抑制,GABA摄取障碍;同时三羧酸循环受到抑制,GABA合成增多,激活了GABA受体。GABA可以抑制NMDA受体偶联的离子通道和电压依赖型Ca2+通道开放,而使神经元处于相对的稳态,平衡缺血缺氧造成的神经元兴奋性异常。因此,GABA及其受体水平的提高也是脑缺血缺氧的标志,而降低的NMDA以及升高的GABA受体是运动性疲劳导致海马记忆功学习能力下降的原因。

纹状体位于基底节,具有参与运动调节和高级认知的作用。结果显示,纹状体部位模型组NR1和NR2A受体与正常对照组比较升高。GABAARα1受体升高,与海马部位的变化趋于一致。NR1是NMDA受体的结构亚基,NR2A是重要的调节亚基。我们的研究结果表明,运动性疲劳时在不同部位的神经核团的兴奋性确实存在差异,表现在海马区神经元以兴奋性递质受体的明显下调为主,而在运动相关脑区纹状体部位表现为兴奋性递质受体的轻度上调。纹状体是对缺血缺氧非常敏感的部位,间接使抑制性递质及其受体水平升高,以使神经元处于相对的稳态。所以,尽管运动性疲劳大鼠纹状体部位的兴奋性递质及其受体水平未见明显下降,由于抑制性递质及其受体的明显上升,纹状体部位的神经元兴奋性也受到抑制。

3.2 中药对谷氨酸、γ-氨基丁酸受体的调节作用

通过疏肝、健脾、补肾中药组与模型组的比较可见,疏肝、健脾方剂四逆散和四君子汤有较好的调节模型动物海马及纹状体区GLU和GABA受体蛋白的作用。其中,疏肝中药组对NR1受体含量的上调作用最好,与正常对照组比较差异无统计学意义。健脾中药组对NR2A受体含量的调节作用更好,与正常对照组比较差异无统计学意义。两方都能够调节升高的GABAARα1表达水平,使之下降趋于正常。健脾类中药能够提高能量代谢,改善缺血、缺氧状态,清除自由基,从而保护由于能量代谢不足导致的兴奋性氨基酸对神经元的损伤。疏肝中药一方面可以和健脾中药共同调节能量代谢异常、清除氧自由基,还具有调节人体的动与静、兴奋与抑制生理功能的作用,对兴奋性与抑制性神经递质及受体的比值起到很好的调节作用。因此,疏肝与健脾中药共同对运动性疲劳导致的GLU/GABA学习记忆调节系统的失调起到了平衡作用,进而改善了运动性疲劳所致学习记忆能力的下降。补肾中药组对学习记忆有一定的改善作用,但是对于GLU/GABA受体的调节作用不明显,提示其可能通过其他途径对学习记忆起到了一定调节作用,其作用机制有待于进一步探讨。

【参考文献】

[1] 侯丽娟,刘晓莉,乔德才.大鼠游泳运动痨劳模型建立的研究[J].实验动物科学与管理,2005,22(1)：1-3.

[2] Francesconi A, Duvoisin RM. Opposing effects of protein kinase C and protein kinase A on metabotropie glutamate receptor signaling：selective desensltization of the inositol trisphosphate/ Ca pathway by phosphorylation of the receptor G protein-coupling domain[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(11)：6185-6190.