膜片钳技术在中药对心肌钙离子通道作用研究中的应用

作者        作者单位

唐瑜 成都医学院病理教研室，成都 610083

The Application of Patch Clamp in the Research of Traditional Chinese Medicine on Cardiac Muscle Calcium Channels

TANG Yu

(Department of Pathology,Chengdu Medical College,Chengdu 610083，China)

Abstract：Patch clamp technique has been widely applied to the basic and application research of biology,physiology,pharmacology since it was invented.And it offers revolutionary test method for biological signal transduction.Recently the technique has been used in the research of the impact of traditional Chinese medicine on ion channels,especially for cardiac muscle calcium channels.The paper made a brief review on the effect of traditional Chinese medicine on calcium channels.

Key words:patch clamp;traditional Chinese medicine;calcium channels

膜片钳技术是以微弱电流信号测量为基础,利用玻璃微电极与细胞膜封接来测量多种通道电流,其测量值可达到皮安级(pA,10-12A),是一种典型的低噪声的测量技术。膜片钳技术的问世给细胞生物学的研究带来了一场革命。当前该技术已经成为细胞电生理学的重要研究方法。尤其是该技术近年来渗透到中医药研究的各个领域,对中医药研究水平的提高起到了很大的推动作用。

1 膜片钳技术的基本原理

膜片钳的基本原理是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100GΩ。由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零。此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。此时可通过膜片钳放大器，选用不同的记录模式(细胞吸附式cell-attached，全细胞模式whoel-cell等)对细胞进行电压和电流钳制，记录各种离子通道电流、细胞的静息膜电位及动作电位等。

2 心肌细胞钙离子通道

1958年Fart和Katz等率先发现了钙离子通道(L型钙通道),目前已证实心肌细胞上存在B型、L型和T型三种钙通道且后二者属电压依赖性通道(Voltage dependent channels ,VDCs)。B型钙通道即背景钙通道(background Ca2+ channels)，是静息钙通道;L型(long-lasting)钙通道是细胞兴奋过程中钙离子内流的主要途径;T型(transient)钙通道的功能与维持细胞自律性和低膜电位(接近静息膜电位)时钙的跨膜运动有关。心肌细胞上的L型钙通道，其启闭对动作电位平台期的形成、细胞内钙离子增高以及心肌细胞的电生理特性等起重要作用。

3 部分中药对心肌钙离子通道的作用

目前膜片钳技术的应用主要在以下几个方面：①离子通道特性的研究;②离子通道活动调控的研究;③离子通道生理与病理情况下作用机制的研究;④单细胞形态与功能关系的研究;⑤药物作用机制的研究。对中药研究而言，现阶段主要使用膜片钳单通道或者全细胞技术，观察中药对离子通道特性的影响来解释药物作用的机理，这将有利于阐明中药在细胞水平的作用机制。我们通过中药提取物对心肌各种钙通道的影响研究，来探讨其防治心率失常、强心的作用机制，或者发现其引起心率失常的离子通道原因。

3.1 人参

现代研究发现人参根中含有多种人参皂甙。包括齐墩果酸型人参皂甙单体R0，人参二醇组皂甙Rc,Rd，人参皂甙Rg1，人参三醇组皂甙单体Rh等。

齐墩果酸型人参皂甙单体R0(200 μmol/ml)对心肌L、B、T型3种类型钙通道的活动均无影响[1]。但是人参皂甙Rg1、人参二醇组皂甙Rc,Rd(1 500 μg/ml)、人参三醇组皂甙单体Rh(160 μmol/L)可使心肌钙通道的平均开放时间缩短,平均关闭时间延长,开放概率减小，但对3种类型钙通道的电流幅值无明显影响,其作用与异搏定相似,与Bay K 8644相反[2～4]。通过与钙通道阻滞剂异搏定(37.5 μg/ml)、钙通道激动剂BAY K 8644(5 nmol/L)的对照实验,证明人参二醇组皂甙Rc(200 μg/ml)对钙通道有阻滞作用而Rd(200 μg/ml)则无此作用[5]。

3.2 粉防己碱

粉防己碱是从防己科多年生木质藤本植物粉防己中提取的。运用膜片钳单通道技术研究发现0.3～300 μmol/L粉防己碱浓度依赖性地阻滞 L型钙电流,半数抑制浓度IC50为13.3 μmol/L，但对其电流-电压曲线无明显影响[6]。全细胞记录研究[7]却发现1 μmol/L粉防已碱可使电流-电压曲线的各电流值均降低，0.1～3.2 μmol/L使钙电流呈浓度依赖性降低,IC50为0.7 μmol/L。此外,0.3 μmol/L就能阻滞异丙肾上腺素0.1 μmol/L引起的钙电流增大。虽然两者在实验具体结果上有差异，但仍证明粉防己碱可阻滞心肌细胞L型钙电流。

3.3 丹参

丹参为活血化瘀的代表药之一，除含脂溶性非醌类成分，丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ-A等外，还有水溶性成分。全细胞记录实验表明,丹参酮Ⅱ-A10、20和40 μmol/L可使L型钙电流的峰值分别减少35.2%、57.7%和74.7%,但对最大激活钙电流的电压依赖曲线及稳定激活曲线无影响[8，9]。同样使用全细胞记录，经过20 min的缺氧以及5 min的复氧后,50、100、200 mg/L丹参分别将兔心室肌细胞L型钙通道电流的峰值从(667.9±158.7)pA减小至(537.1±121.3)pA、(497.2±47.9)pA、(343.8±73.1)pA[10，11]。显然,丹参酮Ⅱ-A具有类似异搏停样L型钙通道阻断剂作用,其阻断作用呈非电压依赖性;丹参能有效地减少缺氧复氧后心室肌细胞的L型钙电流,这种作用可能是其抗心肌缺血以及抗缺血再灌性心律失常的机制之一。

3.4 三七皂甙

通过全细胞膜片钳技术观察：三七皂甙Rb1 10 μmol/L和30 μmol/L分别使Bay K 8644和nifedipine敏感的钙内向电流(即L型钙电流)减少16.2%±3.7%和38.3%±10.4%,且在3-1000 μmol/L范围内,其抑制作用呈浓度依赖关系;同剂量的三七皂甙Rg1对该电流无明显影响[12～13];三七总皂甙100 mg/L和300 mg/L对大鼠心肌细胞L型钙电流的抑制率分别为(26.73±4.5)%和(49±19.6)%[14]。因此可以认为三七总皂甙、Rb1为L型钙通道阻滞剂而Rg1对其无抑制作用。

3.5 黄芪

研究发现黄芪对L型钙电流有双向调节作用。它一般不影响正常心肌细胞L型钙电流的幅度,但可抑制病毒感染细胞L型钙电流的增加,从而防止病毒感染可能导致的细胞内钙超载,对感染细胞起到保护作用[15]。这可能是黄芪用于心肌炎治疗的作用机制之一。另一方面，黄芪还具有恢复受抑制的L型钙电流的作用。急性心肌梗死1周时，兔梗死周边区心室肌细胞L型钙电流受到抑制,电流-电压关系曲线(I-V)上移,失活曲线左移,半数最大失活电位由-13.1±4.2 mV左移至-25.9±7.0 mV,失活速度加快[16]。这可能是急性心梗后室性心律失常发生的原因之一。使用黄芪后，缺血引起的L型钙电流的抑制有部分改善。

3.6 其他中药对心肌钙离子通道作用的研究

3.6.1 具有钙通道激活作用的中药 黄连素[17]、异马钱子碱[18]、甘草次酸[19]、银杏苦内酯B[20]均具有类似钙通道激活剂的作用，但是具体机制又各不相同。黄连素、甘草次酸、银杏苦内酯B可使心肌钙电流明显增加，用异搏定可逆转黄连素的上述作用。小剂量的甘草次酸可使L型钙电流峰值增加，提示甘草次酸可增加L型钙电流,使心肌细胞内钙浓度增加。银杏苦内酯B对生理状态下心肌细胞L型钙电流无明显作用。但可逆转缺血引起的L型钙电流降低，还能使由于缺血而上移的I-V曲线回复正常。异马钱子碱虽然可以激活T型、L型、B型3种钙通道的活动,使其开放时间延长,关闭时间缩短,开放概率增加,但对电流幅度无明显影响。

3.6.2 具有钙通道抑制作用的中药 白花前胡甲素[21]、钩藤碱[22]、川芎嗪[23]、丹皮酚[24]、芍药苷[25]都是浓度依赖性地抑制心肌细胞L型钙通道。而牛磺酸[26]、灯盏花素[27]减少心肌细胞L型钙电流的作用具有明显的电压依赖性和浓度依赖性。

川芎嗪、丹皮酚、芍药苷、青藤碱[28]阻断L型钙电流，但不使I-V曲线的峰值发生偏移。其中丹皮酚、青藤碱可使I-V曲线上移，这些可部分解释其抗心律失常作用机制。芍药苷激活曲线没有明显的改变，失活曲线向较负电压的方向偏移,通道从失活中恢复的时间明显延长。莲心碱[29]阻断L型钙电流后使峰电位略右移，而乌头碱[30]、大豆皂甙单体AI[31]虽然能显著阻断L型钙通道的活动,使其开放时间缩短、关闭时间延长、开放概率下降但对通道的电流幅度无明显影响。

4 讨论和展望

综上所述，中药对心肌细胞钙通道作用的研究不仅品种繁多，而且方法多样，既有膜片钳单通道记录，也有全细胞记录。上述大部分中药具有类似钙拮抗剂的作用，也有少部分类似钙激动剂，例如黄连素、异马钱子碱等。所以上世纪80年代，陈可冀教授率先提出关于中药钙拮抗剂的研究方向。这可看成是钙通道药理学在我国发展的一个特殊分支学科。

目前对中药影响心肌细胞钙通道作用的研究虽多，但是仍存在不少问题。首先，尽管研究已经深入到中药的有效成分，但对中药复方研究的文献尚少。而中医治疗以复方为主，复方研究尽管复杂，但意义重大，需要引起重视。其次，对通道的研究尚处在初层次。文献结果多以开放时间、开放概率、电流幅度、I-V曲线的变化等参数为主。往往满足于观察到对通道表现出抑制或者激活这一现象，而没有进一步分析通道抑制或者激活的原因。我们知道通道的开放受氧化-还原反应、磷酸化或去磷酸化反应、以及蛋白激酶等等因素调控，外界刺激可以直接作用于通道产生作用，或者通过细胞信号转导的途径间接作用于通道。我们施加的中药到底是直接还是间接作用于通道，这就需要单通道膜片钳记录和全细胞记录结合起来一起研究，两者的结果相互参考。如果某种中药施加到浴液中，对通道只有直接作用而无间接作用，理论上电流只出现在全细胞记录，而不出现在单通道记录。而我们目前的研究多只是使用一种膜片钳的记录模式。如果是间接作用于通道，那它信号转导通路的上游和下游途径又是如何的。这些问题都需要我们做进一步的研究。

因此，我们应该把膜片钳技术和PCR技术、激光共聚焦技术结合起来，对通道进行研究。用膜片钳技术研究了单个细胞的通道电学特性后，使用PCR技术对该细胞内这种通道亚基mRNA的表达情况进行分析。细胞内的mRNA水平变化常常反映蛋白产物的变化，激光共聚焦技术可以直接扫描细胞表面的通道蛋白的表达，三者的结合可以确定通道在细胞膜上真正的结构与功能的关系。这应该是今后中药对离子通道作用的一个研究方向。

膜片钳技术在研究离子通道方面有着得天独厚的优势。因此,将膜片钳技术运用于中药对离子通道作用的研究中，不仅仅是验证中药的传统功效,更重要的是可以用现代医学的检测手段和客观检测指标来阐明中药的作用机理,以此为桥梁实现中西医在基础医学上的结合。

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