知柏地黄丸对瘦素诱导特发性性早熟模型小鼠的影响

作者        作者单位    

刘孟渊  广州市中医中药研究所，广东广州

徐雯    广州市中医医院，广东广州

肖柳英  广州市中医医院，广东广州

韩超    广州市中医医院，广东广州

性早熟是一种生长发育异常，表现为青春期特征提前出现。性早熟以女童为多见，其中特发性中枢性性早熟(ICPP)占女孩性早熟的80%～90%，男童性早熟的40%，ICPP的发病机理尚未完全清楚，可能系下丘脑—垂体—性腺轴(HPGA)功能的提前发动所致。由于其确切原因未明，因而无法复制出理想的ICPP动物模型。一般认为青春期的发动需要一定体质量和体脂的积累，瘦素(Leptin)可能涉及获得临界体脂总量的神经内分泌通道的信号作用，这可能是青春期启动的一个允许因子[1]。本实验拟采用Leptin刺激未成熟雌性BALB/c小鼠诱导ICPP动物模型，观察知柏地黄丸对抗ICPP的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 选用18日龄BALB/c雌性小鼠61只，由中国医学科学院上海实验动物中心提供(合格证号：中科动管会第001号)，常规分笼饲养，自然照明，随意取食和饮水。

1.2 主要药物、试剂与仪器 知柏地黄丸由知母、黄柏、熟地黄、山萸肉、牡丹皮、淮山药、茯苓、泽泻等中药组成，所有灌胃中药均选用购自广东一方药厂生产的颗粒剂，用蒸馏水溶解，密封蒸浴加热消毒;醋酸甲地孕酮片由上海信谊康捷药业有限公司生产，批号：030101;抑那通针剂由日本武田药品工业株式会社生产，批号：368;Leptin购自Pepro Tech公司;雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)检测试剂盒购自DR lab.California USA;Mettler Toledo 电子天平(1/1000);贝克曼GS15R台式冷冻高速离心机;Clinic Bio 128C酶标仪。

1.3 动物分组、造模[2]与给药 选用18 日龄BALB/c雌性小鼠61只，常规分笼饲养，自然照明，随意取食和饮水。19 日龄时称体质量，随机分为6组;正常对照组，ICPP模型组，知柏地黄丸高、低剂量组，甲地孕酮对照组，促性腺激素释放激素类似物(GnRHA)组;20日龄时开始造模给药。正常对照组给予生理盐水腹腔注射(i.p)，同时给予蒸馏水灌胃(i.g);其他各组均腹腔注射Leptin(2mg/kg)复制模型，同时，知柏地黄丸高、低剂量组分别给予101.4、50.7g·kg-1·d-1剂量的知柏地黄丸药液i.g，甲地孕酮对照组给予甲地孕酮药液(剂量为3.9mg·kg-1·d-1)，均为上午给药，连续7d;此外，GnRHA组给予GnRHA制剂即注射用醋酸亮丙瑞林(商品名抑那通)，在造模同时以抑那通于右后肢处肌注，隔日1次，首次给药剂量为1 573.5μg/kg，第2、3次给药剂量为1 180 μg/kg，共给药3次。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 阴道开口 据预试验观察正常BALB/c雌性小鼠阴道开口时间一般在日龄26～28d，以27d较为集中。本实验于造模后第3天(即22日龄)开始每天下午4点观察各组阴道开口，26日龄时结束。

1.4.2 体质量变化 每天记录各组小鼠体质量变化，实验结束时，取前后体质量进行比较。

1.4.3 血清黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)含量测定 实验结束时，各组动物称体质量后，摘取眼球眼眶取血，3 500r/min、4℃离心15min，取上清，采用酶联免疫吸附法分别测定LH、E2含量。

1.4.4 子宫、卵巢质量 各组动物眼眶取血后，摘取子宫、卵巢分别称质量，计算脏器指数(w)：w=m脏器/mbody。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件包进行数据处理，计数资料用列联表的Crosstabs过程进行统计学处理，计量资料采用独立样本t检验、及非参数统计的两独立样本秩和检验。

2 结果

2.1 各组小鼠阴道开口情况比较 各组小鼠开始出现阴道开口的天数及小鼠数见表1，正常对照组于造模第5天才有2/9小鼠出现阴道开口，阴道开口的平均天数是6.3d。ICPP模型组于造模第3天即有2/10小鼠出现阴道开口，阴道开口的平均天数是4.6d，比正常对照组提前1.7d(P<0.05)。从造模第4天开始，ICPP模型组与正常对照组的阴道开口小鼠数比较出现差异，造模第4、5、7天，ICPP模型组小鼠的阴道开口较正常对照组提前(P<0.05)，提示Leptin可促进未成熟雌性小鼠阴道开口提前。

GnRHA组于造模第3天即有4/10小鼠出现阴道开口，阴道开口的平均天数是3.1d，比正常对照组提前3.2d(P<0.01)，比ICPP模型组提前1.5d(P>0.05)。造模第4～7天，GnRHA组与正常对照组的阴道开口小鼠数比较，差异均有显著性意义(P<0.05或P<0.01)，表明GnRHA组小鼠阴道开口较正常对照组提前，尤其于造模第4、5天时，提示抑那通短期使用亦可能促进未成熟雌性小鼠阴道开口提前，并与Leptin有协同促进作用。

知柏地黄丸高剂量组于造模第5天才有2/11小鼠出现阴道开口，与模型组比较，于造模第4～6天对Leptin所致阴道开口提前均有抑制作用，尤以造模第5、6天抑制作用明显(P<0.05或P<0.01);知柏地黄丸低剂量组及甲地孕酮对照组于造模第4天均有2/10小鼠出现阴道开口，与正常对照组比较，造模后不同时间点知柏地黄丸低剂量组及甲地孕酮对照组与正常对照组比较，阴道开口数之间差异均无显著性意义(P>0.05)，提示低剂量知柏地黄丸及作为临床使用的阳性对照药甲地孕酮，在本实验中对抗Leptin诱导的开口提前的作用不明显。 表1 各组小鼠阴道开口数比较

统计方法：用列联表分析的Crosstabs 过程进行计算;①P<0.05，②P<0.01，与正常对照组比较;③P<0.05，④P<0.01，与ICPP模型组比较

2.2 各组子宫、卵巢质量及体质量比较 表2结果显示，与正常对照组相比，ICPP模型组小鼠的子宫、卵巢质量有增加趋势，但两组差异无显著性意义(P>0.05);知柏地黄丸高剂量的子宫、卵巢质量较ICPP模型组均有降低趋势，但两组之间差异均无显著性意义(P>0.05)。知柏地黄丸低剂量组子宫质量较ICPP模型组降低(P<0.05)，卵巢质量与ICPP模型比较差异无显著性意义(P>0.05);阳性对照药甲地孕酮能抑制Leptin 所致子宫质表2 各组子宫、卵巢质量及体质量比较统计方法：独立样本t检验;①P<0.05，②P<0.01，与正常对照组比较;③P<0.005，④P<0.001，与ICPP模型组比较

量的增加(P<0.05)，但对卵巢质量影响不明显(P>0.05)。与正常对照组和ICPP模型组比较，GnRHA 组小鼠子宫、卵巢质量均增加(P<0.05或P<0.01)，尤以子宫质量增加显著(P<0.01)，提示抑那通可促进性腺生长，并与Leptin 具有协同促进作用。

知柏地黄丸高、低剂量组及甲地孕酮对照组对小鼠体质量无显著影响(P>0.05);与正常对照组及ICPP模型组比较，GnRHA组小鼠体质量增加(均P<0.05)，提示抑那通具有增加幼龄雌鼠体质量的作用。

2.3 各组子宫、卵巢指数比较 为排除子宫、卵巢质量增加是由于体质量变化影响所致，比较各组子宫、卵巢指数(分别以子宫或卵巢质量除以体质量)的变化。表3结果显示，与正常对照组比较，ICPP模型组小鼠的子宫指数、卵巢指数均有升高趋势，尤以子宫指数升高明显，但两组差异无显著性意义(P>0.05)。提示Leptin虽具有一定的促进性腺生长，升高子宫指数、卵巢指数的作用，但作用不明显。

与ICPP模型组比较，低剂量知柏地黄丸能抑制 Leptin 致子宫指数和卵巢指数升高(P<0.05或P<0.01);高剂量知柏地黄丸亦能使子宫指数和卵巢指数下降，但两组之间差异无显著性意义(P>0.05)。

甲地孕酮能抑制 Leptin 所致子宫指数的升高(P<0.05)，但对卵巢指数无显著影响(P>0.05)。

与正常对照组比较，抑那通能升高卵巢指数和子宫指数(P<0.05或P<0.01)，与模型组比较，GnRHA 组子宫指数升高(P<0.01)，提示抑那通能促进性腺生长，升高卵巢指数和子宫指数，并可能与 Leptin 具有协同促进作用。表3 各组子宫指数、卵巢指数比较

统计方法：独立样本t检验;①P<0.05，②P<0.01，与正常对照组比较;③P<0.05，④P<0.01，与ICPP模型组比较2.4 各组血清 LH、E2水平比较 表4结果显示，与正常对照组比较，ICPP模型组的LH水平升高(P<0.01)，提示 Leptin 有诱导模型动物LH 分泌的作用，但ICPP 模型组E2 水平与正常对照组比较差异无显著性意义(P>0.05);GnRHA 组的 LH 和 E2 水平均较正常对照组及 ICPP 模型组升高(P<0.01)，提示抑那通对 Leptin 升高 LH 和 E2水平的作用具有协同促进效应。

与 ICPP 模型组比较，除 GnRHA 组外，各给药组的 LH 水平降低(均P<0.01)，各剂量中药及甲地孕酮均具有对抗 Leptin 诱导 LH 水平升高的作用。但高、低剂量的知柏地黄丸对E2 水平均无显著性影响(P>0.05)。

3 讨论

阴虚火旺是 ICPP 的主要病机，因而滋阴降火表4 各组血清 LH、E2 水平比较 统计方法：独立样本t检验;①P<0.01，与正常对照组比较;②P<0.05，③P<0.01，与ICPP模型组比较

是 ICPP 的主要治疗法则[3]。知柏地黄丸是滋阴降火的传统名方，治疗特发性性早熟(真性性早熟)和假性性早熟均取得一定疗效[4]。

ICPP 主要是因于 HPGA 功能的提前发动。青春期是一个性成熟的过程，而青春发育启动主要是促性腺激素释放激素(GnRH)脉冲释放频率和峰度增加所触发，尤其是夜间 GnRH 脉冲式分泌的增加，被认为是青春期开始启动的标志[5]。但 GnRH 脉冲释放频率和峰度增加的确切机制仍然未明。有学者认为，只有基本体脂达到最低阈值才能维持正常的月经周期和触发青春期，此即临界体脂学说。其中 Leptin 在感知机体的营养状态及个体大小和体脂含量，从而启动 GnRH 的高频率释放中起关键作用[6]。

在人类性成熟和未成熟个体内，Leptin 的循环水平有显著性差异，且 Leptin 先于青春期前生殖激素尚未升高之时升高[7]，因此，Leptin 可能是人类青春发育启动的允许因子(但并不是唯一的青春启动刺激因子)。当 Leptin 作为一种外源性刺激作用于初情期前的动物，可能使 HPGA 功能提前发动，从而模拟人类 ICPP 主要病理生理变化。

本实验采用 Leptin 诱导刚离乳的 BALB/c 雌性幼鼠复制 ICPP 动物模型，结果发现 Leptin 可致模型小鼠阴道开口提前，LH 水平升高，E2水平、子宫质量和子宫指数、卵巢质量和卵巢指数有增加的趋势，提示 Leptin 有一定的促进子宫、卵巢生长发育的作用，与 Farid 等的研究结果一致[2]。以上结果表明 Leptin 在诱导性早熟的过程中发挥了启动因子的作用，其可能通过使 LH 分泌增加提前启动垂体—性腺轴的功能，从而诱导性成熟的提前。

第二性征的提前发育是 ICPP 的临床特征。雌鼠(啮齿类动物)最能代表第二性征发育的指征即是阴道开口，本实验发现知柏地黄丸高剂量组从造模第3天起即对 Leptin 促进幼龄雌鼠阴道开口提前具有抑制作用。

性腺轴功能的启动，可促进其靶腺—子宫和卵巢的生长发育。知柏地黄丸低剂量组对 Leptin 诱导的子宫质量、子宫指数及卵巢指数升高有显著抑制作用。

观察各组小鼠体质量的变化，可以反映性成熟的启动与体质量和体内能量代谢的关系。本实验中发现，模型组小鼠体质量略为减轻，与正常对照组比较差别无统计学意义，提示 Leptin 调控生殖功能的生理作用并非继发于其对体质量和能量平衡的调节。这是与临界体脂学说不一致之处，但与 Ahima 的研究结果一致[8]。知柏地黄丸高、低剂量均无对抗 Leptin 减轻体质量的作用。

LH 是初情期的标志，LH 优势性升高为 ICPP 的临床标志之一[9]。LH 在正常月经周期中呈周期性变化，在排卵前达到峰值，因而亦作为预测排卵常用的最显著的激素标准。本实验发现 Leptin 能诱导 ICPP 模型小鼠 LH、E2 水平升高，这与 Chehab 等的实验结果不一致，Chehab 等于雌鼠出现动情期的29日龄时，采血测定 LH、E2水平，结果显示均低于磷酸盐缓冲液(PBS)组，该学者认为是与实验组动情期较早出现是一致的[2]。本实验ICPP模型小鼠LH、E2升高，可能因于26日龄的动物处于不同的动情周期如排卵前期所致;同时发现高、低剂量的知柏地黄丸有对抗 Leptin 诱导 LH 升高的作用，但对E2水平无显著影响。

综合所述，以 Leptin 腹腔注射于幼龄 BALB/c 雌鼠，可提前启动垂体—性腺轴功能，给促性腺激素分泌以许可信号，诱导 ICPP 的出现。知柏地黄丸可能是通过抑制 Leptin 诱导垂体—性腺轴功能的提前启动，抑制垂体分泌 LH 进而抑制E2 的分泌，或直接抑制 Leptin 对性腺的作用，从而降低 Leptin 诱导的子宫质量及质量指数升高，抑制 Leptin 诱导的幼龄雌鼠阴道开口的提前，发挥其对抗 Leptin 诱导性早熟的作用

【参考文献】

[1]Zhang Y,Proenca R,Maffei M,et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J].Nature,1994,372:425.

[2]Farid F Chehab,Khalid Mounzih,Ronghua Lu,et al.Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin [J].Science,1997,275(3):88.

[3]时毓民，俞建.性早熟女童阴虚火旺本质的探讨[J].中国中西医结合杂志，1997，7：30.

[4]杨美琳，刘妍，申巧玲.知柏地黄丸治疗儿童性早熟25例结果分析[J].河南中医 1999，5：59.

[5]陈非.瘦素与男性青春期发育[J].国外医学：妇幼保健分册，2002，13(4)：177.

[6]黄荷凤.瘦素对生殖功能的影响[J].浙江医学，2002，24(4)：198.

[7]赵咏桔，陆洁莉，唐金凤，等.女性神经性厌食症患者的瘦素水平及其在生殖功能调节中的作用[J].中华内分泌代谢杂志，2006，22(4)：329.

[8]Ahima R S ,Prababaran D,Mantzoros C,et al,Role of leptin in the neuroendocrine response to fasting[J].Nature,1996,382:250.

[9]宋文惠，王德芬.瘦素与青春发育[J].中华内分泌代谢杂志，2000，16(5)：328.