五味子多糖对环磷酞胺致生精障碍大鼠的治疗作用及对生殖激素的影响

少精或弱精等精子质量异常是男性不育的主要原因。目前治疗少精症及弱精症的药物较少，治疗效果也不明显，传统中药方剂在改善男性生殖功能方面具有良好疗效[2一4]，因此研制和开发中药有效成分，并研究其在生殖保护方面的作用具有良好的应用价值。五味子为木兰科五味子属植物，具有补肾、益气、生津、固涩等功效，临床用于治疗久咳虚喘、梦遗滑精、津伤口渴、气短脉虚、内热消渴和心悸失眠等症。现代药理学研究证明，五味子不仅对免疫系统、心血管系统、神经系统等具有调节作用，还有抑制肿瘤、抗氧化、抗衰老等作用[5]。补肾壮阳中药多糖对雄性大鼠生殖系统有保护作用[6]。前期实验发现，五味子多糖有改善大鼠生精功能的作用(另文发表)，但五味子多糖的生精作用尚缺乏系统和深人的研究。本实验研究五味子多糖对环磷酞胺(CTX)诱导的生精障碍大鼠的治疗作用，为五味子多糖防治生殖障碍的临床应用提供实验基础和理论依据。

材料与方法

1动物SPF级健康雄性Wistar大鼠50只，体重(190士，0) g,购自吉林大学实验动物中心，合格证号: SCXK(吉)2008一0005。适应性饲养，环境温度(22士 2)℃。

2药物及试剂北五味子，购自吉林大药房;注射用CTX(批号:11061921)，购自江苏恒瑞医药股份有限公司;卵泡刺激素(FSH，批号:20100627)、黄体生成素(LH，批号:20100908)和肇丸组织匀浆攀酮 (批号:20100415)酶联免疫试剂盒，购自北京科美东雅生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

3五味子多糖的制备取北五味子果实500 g , 洗净后研磨成粉，参考文献[7]方法并加以改进，以醇碱法提取五味子多糖。提取液醇碱溶剂pH值为 7. 8，含醇浓度为7%，提取温度为100℃，料液比为 1:25，提取2次，每次1.5 h，提取总时间为3h，得浅棕色粗多糖。用Seveg法除蛋白，并加人10 g/L活性炭脱色，并将滤液于透析袋中透析48 h，除去无机 盐，得多糖纯化物。以葡聚糖溶液为对照品做标准曲线，用苯酚一硫酸比色法测定多糖含量。样品含糖量约为46.5 mg/go.

4分组、造模及给药50只Wistar大鼠适应性喂养5天后，以单纯随机抽样法分为正常组、模型组以及五味子多糖低、中、高剂量组，每组10只。除正常组外，根据预实验结果以及参考文献[8〕方法给予其余4 组腹腔注射CTX 80 mg/(kg·d)，连续5天，制备生精障碍模型。造模大鼠于开始腹腔注射CTX第2一3 天起，逐渐出现精神萎靡，恶寒，体毛稀疏、无光泽，消瘦，甚至体重下降。造模后，五味子多糖低、中、高剂量组分别给予五味子多糖100 ,200 ,400 mg/( kg·d) (分别相当于成人剂量的5,10 ,20倍)灌胃，正常组和模型组均灌胃等体积生理盐水，各组灌胃给药容积为 0. 5 m L/m g，均每天1次，连续60天。

5观察指标及检测方法

5. 1取材全部大鼠末次给药后24 h，称体重，腹主动脉取血并分离血清。取右侧翠丸放人4%福尔马林固定行组织形态学检测。左侧取附票和翠丸，其中攀丸制成匀浆，以3 000 r/m in离心10 min，取上清液，一20℃冰箱保存待测;附聚进行精子数及精子活动率检测。

5. 2精子密度、活率及畸形率测定将盛有 10 mL精子营养液的试管置于恒温水浴箱中预热至 37℃，取单侧附肇去除结缔组织和脂肪，眼科剪剪碎组织并放人试管中，37℃静止10 min，待精子充分游离。取，滴滴于血细胞计数板上，按照细胞计数法计算精子密度。另从试管中取5uL与等量伊红一丫混匀，室温下放置10 min，加盖玻片，在光镜下观察，死精子被染色呈粉红色，活精子不被染色而胞质透明。每份标本计数200个精子，计算精子活率;另从试管中取5 uL用甲醇固定5 min，晾干后用2%伊红水溶液染色1h，冲洗，吹干。在低倍镜下找到背景清晰，精子重叠较少的部位，用高倍镜按顺序检查精子形态。每只大鼠检查完整的精子1 000个，精子头部无钩、香蕉形、无定形、胖头、 双头等判定为畸形，计算精子畸形率。

5. 3生殖激素测定取分离后血清，利用酶联免疫试剂盒测定血清FSH和L日及翠丸组织匀浆下水平，实验步骤和方法按照试剂盒说明书完成。

5. 4聚丸组织形态学观察取大鼠梁丸石蜡切片，HE染色，光镜观察肇丸组织内精原细胞与各级生精细胞的分布情况。

6统计学方法应用SPSS 15. 0统计学软件进行统计分析。计量资料以X士S表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P<0. 05为差异有统计学意义。

结果

1各组大鼠精子密度、活率及畸形率比较(表1) 与正常组比较，模型组大鼠精子密度和精子活率降低，精子畸形率升高，差异均有统计学意义沪< 0. 01)。与模型组比较，五味子多糖各剂量组精子密度和精子活率提高，精子畸形率降低，差异均有统计学意义 (尸<0. 01尸< 0. 05 )。与五味子多糖低剂量组比较，五味子多糖中、高剂量组精子密度和精子活率升高，精子畸形率降低，差异均有统讨一学意义(P <0.05,P< 0. 01)，且五味子多糖高剂量作用优于五味子多糖中剂量(尸<0. 05 )。

2各组大鼠生殖激素比较(表2)与正常组比较，模型组血清FSH和LH含量增高，肇丸组织匀浆丁含量降低，差异均有统计学意义(P < 0. 01)。与模型组比较，五味子多糖各剂量组血清FSH和LH含量降低，肇丸组织匀浆丁含量增高，差异均有统计学意义 (P<0.05,P<0.01)。与五味子多糖低剂量组比较，五味子多糖中、高剂量组血清FSH和LH含量降低，肇丸组织匀浆丁含量增高，差异均有统计学意义沪< 0. 05 ,P < 0. 01)，且五味子多糖高剂量作用优于五味子多糖中剂量沪<0. 05)。

3各组大鼠肇丸组织形态学比较(图1)光镜观察，正常组肇丸生精小管直径宽，排列密集，生精上皮厚，生殖细胞层次和数量多，生精小管均见精子形成。模型组大鼠票丸生精小管退化、萎缩，生精上皮变薄，上皮层数减少，排列紊乱，腔内精子数目减少。与模型组比较，五味子多糖低剂量组生精小管生精上皮层数增多，排列较规则，生精小管退化、萎缩的现象明显好转; 五味子多糖中剂量组生精小管结构改善更加明显，生精上皮层数和数量明显增多，排列整齐;五味子多糖高剂量组肇丸生精上皮层数较模型组显著增多，各级生精上皮排列规则，腔内有成熟精子，基本为完整的肇丸组织形态。讨论 CTX是临床常见的抗肿瘤药物，其主要通过对 DNA的烷化作用干扰细胞内多种生物学功能。生殖毒性是CTX的主要副反应之一。临床研究表明， CTX的生殖毒性可引起无精症或少精症，导致不育或子代遗传性缺陷或畸形的发生[11]。 五味子是传统的滋补中药，具有收纳肾气、固精止泻、补肾宁心的作用，《本草纲目》中记载五味子具有 “辛卜元气之不足，吸耗散之气“及”壮水镇阳”之功效，也是传统的治疗男性生殖功能障碍的常用组方药。 本研究利用CTX制备大鼠生精障碍模型，并探讨五味子多糖对CTX所致生精障碍的保护作用。

结果显示:与正常组比较，模型组大鼠精子密度减少，精子活率降低，精子畸形率增高，差异均有统计学意义 (P <0. 01)。五味子多糖各剂量组精子密度增加，精子活率增强，精子畸形率降低，与模型组比较，差异均有 统计学意义(P<0.01,P<0.05)二表明五味子多糖对受损肇丸及精子的形成具有显著的促进作用。攀丸组织学观察显示，五味子多糖治疗后模型大鼠果丸生精上皮层数明显增多，细胞层次分明，生精细胞排列整齐、紧密，管腔内可见较多精子，提示五味子多糖在改善和恢复生殖细胞形态方面具有较好作用。 翠丸的生精功能受下丘脑一垂体一性腺轴内分泌激素水平的调控。FSH ,LH为垂体分泌的糖蛋白类激素，FSH与曲细精管的支持细胞膜受体结合，刺激性激素结合球蛋白的生成，使得曲细精管腔内丁维持较高水平，以促进生殖细胞分化为成熟的精子。LH 主要促进肇丸间质细胞增生，刺激间质细胞合成和分泌丁，以供精子生成的需要。LH可协同FSH促进精子成熟，并与精子活动力有关[13]二本研究模型组血清 FSH和LH水平较正常组明显增高，肇丸组织匀浆丁水平明显降低，可能因为CTX通过诱导间质细胞和支持细胞大量凋亡，使丁分泌减少，下丘脑一垂体一性腺轴反馈性调节促进腺垂体分泌FSH和LH，使二者血清水平反应性增高。五味子多糖各剂量组FSH和LH 水平均降低，尤其高剂量组基本恢复到正常水平，且五味子多糖各剂量组丁水平也显著增高。提示五味子多糖可能通过促进肇丸组织再生，使激素分泌正常，恢复下丘脑一垂体一性腺轴调控作用而达到提高精子数量和质量，改善生精功能的作用。本研究初步探讨了五味子多糖对CTX致生精障碍大鼠的治疗作用，为五味子多糖在生殖不育中的应用奠定了基础.

参考文献

[1] 马伯艳,张福利,宋琳,田旭升. 化瘀温胆汤对代谢综合征大鼠胰岛素抵抗干预作用的实验研究[J]. 中医药信息. 2011(01)

[2] 杨旭东,张杰,申梅淑. 牛膝多糖对2型糖尿病大鼠脂肪分化相关蛋白表达的影响[J]. 药物生物技术. 2010(04)

[3] 郭红梅,曾斌芳. 芪茵颗粒对非酒精性脂肪肝大鼠瘦素及胰岛素抵抗的影响[J]. 新疆中医药. 2008(03)

[4] 吕秀芳,孟庆宇,郭新民. 地黄水提液对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及resistin基因mRNA和蛋白表达的影响[J]. 中国中药杂志. 2007(20)

[5] 张琦,江泳,陈建杉. 苓桂术甘汤对高脂血症大鼠血流变学影响的实验研究[J]. 成都中医药大学学报. 2003(03)

[6] 冷萍,杨淑萍,时萍,张洁,曹志红. 扶正化痰活血方对2型糖尿病模型大鼠胰岛素抵抗的影响[J]. 中国实验方剂学杂志. 2007(08)

[7] 廖靖,蔡东红. 麦冬多糖对妊娠期糖尿病小鼠胰岛抵抗作用的影响[J]. 齐鲁药事. 2011(08)

[8] 宗灿华,田丽梅. 枸杞多糖对2型糖尿病胰岛素抵抗模型大鼠resistin基因表达的影响[J]. 药物生物技术. 2008(04)

[9] 赵兴国,李丽. 三七总皂苷对大鼠非酒精性脂肪肝模型胰岛素抵抗及瘦素受体表达的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志. 2008(06)

[10] 张杰,吴淑艳,王琳,王冠梁,朱德增. 熊果酸对高脂饮食诱导胰岛素抵抗大鼠脂质代谢的影响[J]. 中华中医药学刊. 2010(05)