原发性肝癌介入治疗围手术期不同中医证型的血清蛋白表达差异

表面加强激光解析电离化飞行时间质谱法(sur- face enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)蛋白芯片技术操作简便，且能发现和捕获肝癌新的或未知的特异性相关蛋白，有利于肝癌的早期诊断和个体化治疗，目前成为监测肝癌的热潮并初见端倪[1-3]。本研究初步分析原发性肝癌介人治疗围手术期不一同中医证 型的血清蛋白差异表达，并尝试探讨其临床意义。

资料与方法

1诊断标准原发性肝癌诊断参照《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》[4]。

2纳人及排除标准纳人标准:(1 )符合原发性肝癌诊断标准;(2)中国分期I一IIIA期无远处转移或巴塞罗那(BCLC)分期A/B /C无肝外转移者;(3) 所有具备经导管肝动脉化疗栓塞(TACE)治疗适应症的II期患者和部分IQ期患者;(4)预计生存期在3个月以仁，生活质量Karnofsky评分)60分者;(5)签署知情同意书。排除标准:(1)年龄<18岁;(2)妊娠期或哺乳期妇女;(3)凡已接受过抗癌治疗者(包括全身化疗、动脉插管化疗及栓塞治疗)，局部放疗、已行手术者，冰冻或无水酒精注射有效未超过3个月者.

3中医辨证分型标准按照《中药新药临床研究指导原则(试行)》[5]进行中医辨证分型。(1)肝郁证，主症:右胁闷胀窜痛，胸闷，喜太息，情志抑郁，易怒，右胁肋下痞块;次症:纳呆食少，院闷暖气，时有恶呕、腹泻;舌苔薄腻，脉弦。(2)血疲证，主症:胁下痞块巨大.胁痛引背，痛处不移，拒按，院腹胀满，面色晦暗;次症:纳呆食少，神疲乏力，形体消瘦，暖气，大便搪结不调;舌质紫暗，有疲斑、癖点;脉沉细或弦涩(3) 脾虚证(或兼湿困)，主症:神疲乏力，纳呆食少，腹胀，食后尤甚，大便澹泄，胁下痞块;次症:少气懒言，口豁不欲饮，恶心、呕吐;舌淡，舌边有压迹，舌苔厚腻;脉细弦或滑濡。(4)湿热证(或热毒)，主症:心烦易怒，口苦口干，胁肋胀痛灼热，黄疽，搜赤便干，胁下痞块;次症:纳呆食少，发热烦渴，院腹胀满，头晕耳鸣;舌红或绛，苔黄腻;脉弦滑或滑数。(5)阴虚证，主症:胁肋灼痛，腰膝酸软，五心烦热，头晕失眠，口苦咽燥，形体消瘦，胁下痞块;次症:食少，腹鼓胀，青筋暴露，出血，低热盗汗;舌质少苔或光剥，脉细而数。

4一般资料选择2008年9月一2011年12 月期间收治于福建省第二人民医院介人科经病理确诊的肝癌患者 154例，均符合纳人标准。收集患者的四诊信息资料，对介人前154例肝癌患者进行辨证，其中肝郁证37例，脾虚证45例，湿热证18例，血疲证 28例及阴虚证26例。

5 SELDI蛋白芯片技术检测

5.1标本采集清晨5:00时空腹抽取患者介人治疗前后各1周时外周血3一5 mL，置4℃冰箱放置2 h,2 000 r/min离心(离心半径6.7 cm)5 min，取上清液以50 uL分装放置一80℃冰箱保存待用。

5. 2芯片预平衡取弱阳离子交换芯片CM10 (美国Ciphergen公司)装在生物芯片处理器(Biopro- cessor)加样架上，每孔加人CHAPS缓冲液 (50 mmol/L NaAC,pH 4.0，美国Sigma>200 uL置于水平摇床振荡5 min，弃溶液，重复上述步骤1次。

5. 3血清样品稀释取5uL血清，加10uL U9处理液(9 mol/L Urea, 2}} CHAPS, 1 % DTT, 50 mmol/L Tris一HCL，pH 9. 0)，充分混匀，水平振荡器上冰浴振荡30 min(400一600 r/min)，加180uL 缓冲液混匀。

5. 4上样及洗脱取稀释好的血清样品100uL 加人平衡好的芯片，摇床振荡孵育1 h，甩去样品，用 200uL缓冲液室温振荡洗涤2次，每次5 min .

5. 5加能量吸收分子取出芯片，晾干后，每孔加能量吸收分子、芥子酸(美国Ciphergen公司) 1uL，滴加2次.

5. 6数据收集制备好的芯片放人PBSII-C型蛋白芯片阅读机读取芯片信息，用Ciphergen pro- teinchip3.0.2版本的分析软件(芯片及软件购自美国Ciphergen公司)采集数据.

5. 7统计学方法将所读取的图谱进行归一化处理，采用Biomaker Wizard软件分析肝癌患者不同证型间介入治疗围手术期外周血清蛋白指纹图谱的差异。其出现频率阑值为20%，信噪比最低为5，对不同组中相同质荷比(M/Z)的蛋白质含量数据进行方差分析，P < 0. 05为差异有统计学意义。

结果

1介人治疗前肝癌患者不同证型间血清差异蛋白峰(表们采用Biomarker Wizard软件对介人前 1周肝癌患者不同中医证型间外周血清蛋白质谱图进行比较和统计学分析二结果显示:M/ Z为3 392, 4 970 ,5 911 ,6 200 ,8 575 Da的血清蛋白质峰在不同证型间的表达比较，差异有统计学意义沪<0.05, P<0.01);_上述5个差异蛋白峰同时出现于脾虚证和血癖证中。

2肝癌介人治疗围手术期不同中医证型血清蛋白指纹图谱的差异性分析(表2，图1)针对介人前 154例肝癌患者不同证型间出现的5个血清差异蛋白，应用Biomarker Wizard软件于术后1周对比研究各自相同质荷比的蛋白表达差异。结果显示:阴虚证中M/Z为8 575 Da的差异蛋白峰表达下调，差异有统计学意义(P < 0. 01)，其余证型介人前后差异蛋白峰表达无明显改变沪>0.05)。

讨论

SELDI蛋白芯片技术以其高通量、快速、平行、自动化等优点，为蛋白质组学研究肝癌提供了强大的技术支持。苏乃伦等[6]经SELDI检测到肝癌组(30 例),HBV阳性携带者(20例)及正常人(20名)中共有25个蛋白质差异有统计学意义，并以其中5个蛋白标志物(M/ Z为6 888 ,13 764 , 6 487 , 3 450和 6 814 Da)建立了筛选模型。司少艳等厂[7]运用质谱分析共筛选出13个肝癌小鼠血清差异蛋白，其中M/Z 为2 687. 6 ,2 800. 8 ,8 532. 9 ,9 298.1 Da的蛋白具有早期诊断价值;M/Z为3 006.7,6 432.0,6 650.9, 9 637. 2 ,1 283. 8 ,1 520. 0 ,1 536. 5,1 546.4 Da的蛋白可能与肝癌的发生、发展密切相关。张志勇等[8]通过对肝癌患者术前血清与慢性肝病患者血清蛋白质谱分析发现共有38个蛋白质表达量有明显差异，并获得相 对分子质量为M3 815 , M4 678 , M4 703 , M4 881 , M5 304 , M5 716、M6 203、M7 789、M7 988、M8 168、 M9 312这11个蛋白质组成的模型。

本研究发现原发性肝癌患者介人前不同证型间存在着M/Z为3 392 ,4 970 ,5 911 ,6 200 ,8 575 Da等 5个差异蛋白峰，介入后阴虚证的M/Z为8 575 Da 的血清蛋白表达明显下调，说明肝癌介人治疗围手术期不同中医证型的血清蛋白指纹图谱有明显差异，在蛋白组学水平上进一步促进了肝癌中医辨证分型客观化研究的发展。 近年来与肝癌中医证型较密切的肝功能、免疫功能、肿瘤标志物、影像学等指标的研究报道屡见不鲜，这些成果对阐述肝癌的病机传变、指导辨证论治和分析预后具有一定的意义。张红等发现肝癌患者血清甲胎蛋白(AFP),y一谷氨酞基转移酶( y-GT ) , 癌胚抗原(CEA)、碱性磷酸酶(AKP)、铁蛋白(S Fe ) 水平显著高于健康人，且脾气虚证、肝郁脾虚兼癖血阻络证患者血清AFP,CEA高于肝气郁结证、疲血阻络证。本研究发现介人治疗前脾虚证和血疲证有5个差异蛋白峰与其他4个证型存在明显差异，提示脾虚、血痪是肝癌的主要病机之一。所以《医林绳墨·积聚》说:“积者，……血之积也”;又如《景岳全书》曰:“凡脾不足及虚弱失调之人，多有积聚之病”。 本研究将继续跟踪肝癌患者介人治疗后与健康对照组、二次以上介人治疗围手术期、中医辨证虚实夹杂证、数型并见证等既有的5个蛋白峰差异表达，扩大临床病例数并分析此模型的灵敏度及特异性，以期更全面更准确地阐述肝癌的病机传变及各证型之间的差异与联系。

参考文献

[1]徐明辉,李若林,何亚妮. SELDI-TOF-MS蛋白芯片技术在原发性肝癌诊断中的应用研究[J].广西医科大学学报,2011,(06):843-845.

[2]胡育斌,林海澜,郝明志. SELDI-TOF-MS技术在肝癌诊断和介入治疗评价中的价值[J].世界华人消化杂志,2012,(13):1107-1111.

[3]李长煜,王小林. SELDI蛋白质芯片技术在肝癌研究中的进展[J].复旦学报(医学版),2010,(03):374-376.

[4]中国抗癌协会肝癌专业委员会. 原发性肝癌的临床诊断与分期标准[J].中华肝脏病杂志,2001,(06):324.

[5]郑莜萸. 中药新药临床研究指导原则(试行)[M].北京:中国医药科技出版社,2002.210-212.

[6]苏乃伦,牟文凤,王斌. 应用SELDI-TOF-MS技术筛选肝癌血清蛋白标记物[J].中国现代医学杂志,2012,(13):53-56.

[7]司少艳,张军,杨鹤鸣. 应用SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术筛选正常和肝癌小鼠血清差异蛋白[J].肿瘤学杂志,2009,(07):644-648.

[8]张志勇,覃健,何敏. 应用SELDI-TOF-MS技术筛选肝癌血清标志物的研究[J].现代预防医学,2010,(24):4609-4611.

[9]张艳玲,李永浩. 肝癌中医证型与客观指标关系的研究进展[J].中医药导报,2007,(05):95-96.

[10]张红,曾柏荣,陈孟溪. 原发性肝癌血清肿瘤标志物水平的变化与中医辨证分型的关系研究[J].湖南中医药导报,2001,(12):600-601.