银杏叶提取物EGb761对中枢脱髓鞘大鼠神经保护作用的研究

作者             作者单位

王焱新    黑龙江省哈尔滨市儿童医院 150010

郝艳秋    哈尔滨医科大学附属第二医院儿内科  150086

实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)亦称实验性自身免疫性脑脊髓炎，是一种以特异性致敏的CD4+细胞介导为主的，以CNS内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，是人类脱髓鞘疾病的理想动物模型，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义[1]。由于传统的脱髓鞘疾病的治疗，药物多，疗程长，副作用大，效果不尽满意，故本研究对EGb761对CNS 的作用尤其是神经保护及髓鞘再生作用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Wistar大鼠30只，雌性，6～8周龄，体重160～180g，豚鼠2只，雌雄不拘，体重450～550g，CFA购自Sigma公司，百日咳疫苗(BPV)购自北京生物研究所，EGb761德国威玛舒培大药厂生产，NSE购自武汉博士德生物制品公司，MBP购自华西医科大学。

1.2 GPSCH-完全抗原的制备 豚鼠麻醉，以生理盐水左心室灌注直至无血液流出，取出豚鼠脊髓，称重，加入等量的生理盐水，制成质量/百分比浓度为50%的GPSCH。将GPSCH与CFA等体积混合，用注射器反复抽推，制成油包水乳剂。

1.3 动物分组及诱导方法 Wistar大鼠随机为3组，NC组，EAE组，EGb761组，每组10只，EGb761组于免疫当日给予后肢足垫皮下分别注射抗原0.4ml/只，BPV0.25ml/只及腹腔注射EGb7610.5ml /只，EAE组动物后肢足垫皮下分别注射抗原0.4ml /只，BPV0.25ml/只，NC组与EAE组给予等量的生理盐水腹腔注射，观察动物发病情况，给药14d采血，处死动物。记免疫当日为0天，每日称重并进行临床症状评分。

1.4 症状分级评分 EAE的神经症状根据Kono等提出的标准分为5级：评分标准为0级：无任何临床症状;1级：动物尾巴无力;2级：尾部无力+肢体无力;3级：肢体轻度麻痹;4级：肢体严重麻痹，被动翻身后不能复原;5级：濒死状态或死亡。症状介于两条标准之间±0.5分计。

1.5 取材标本采集 4%多聚甲醛内灌注固定，解剖取其大脑视交叉前后2 mm 组织，脑桥和小脑，脊髓胸、颈、腰膨大处水平横断，常规石蜡包埋，切片HE染色，观察病理变化。

2 结果

2.1 动物神经行为变化 EAE组，于免疫后的第10d开始，出现运动减少，饮食下降，对刺激反应迟钝，体重下降的症状，第11～12d出现尾巴下垂，无力，自后肢开始的进行性的全身瘫痪，继续体重下降，平均为(22.38±10.80 g)，最低降低达45g，严重者达濒死状态。EGb761组，于免疫后的第12 d开始，出现体重下降，症状较轻，出现尾巴下垂，后肢无力，严重的后肢瘫痪，无发展到前肢瘫者，体重下降幅度小，平均为(10.14±6.52g)，症状较快恢复。NC组大鼠体重持续增长，体重每日增加3 g左右，活动正常，进食正常，无异常神经活动行为，对外界反应灵敏。

2.2 病理变化 光镜下，症状评分3分以上的EAE动物：大量的炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，炎性细胞聚集在间质血管周围呈现血管“袖套” 样改变。神经元细胞明显肿胀、变性、坏死。轴索消失。

脊髓较脑部的病变严重，腰骶段病变最显著，炎细胞浸润弥散，灰白质均受累，尤以灰白质交界区最重，可见淋巴细胞和神经胶质细胞增生。神经元细胞明显肿胀、变性、坏死。胞核偏位，尼氏体消失。在白质内许多纤维神经膜破裂，轴索消失。

脑部病变以白质损害相对严重，视交叉上方，丘脑，脑室周围及脑干有多处炎细胞浸润，细胞肿胀，变性。EGb761组大鼠脑和脊髓与EAE组比较，炎性细胞聚集、浸润较轻。神经元细胞肿胀、坏死减少。NC组大鼠未见炎性细胞，神经元细胞形态正常，轴索完整。(病理切片略)

3 讨论

大量研究表明[2-4]，EGb761对CNS有广泛的作用：可以改善人或动物的记忆和认知能力，降低脑缺血后组织丙二醛和一氧化氮产物含量，改善脑水肿、并能促进CNS的可塑性及脑损伤后功能的恢复等，但是银杏叶对于神经保护和髓鞘再生的研究并不多见。在1992年，Lacouv首次提出了EGb 的神经营养性和神经再生假设，认为EGb 有某种类似单唾液酸神经节苷脂的神经营养和促进神经再生的作用，在运动神经再生过程中，可发生短暂的肌细胞的多重支配。修复神经损伤，起到神经保护的作用。

实验发现，EGb761组脑和脊髓病理组织中炎性细胞浸润，炎性细胞聚集所呈现的“套袖”征现象，神经细胞的变性，死亡少于EAE 组，说明GPSCH 中的抗原物质可以诱发对神经髓鞘抗原的免疫应答，引起神经细胞的变性，坏死及髓鞘的脱失，引起脑和脊髓损伤，而EGb761可以保护神经细胞，加速髓鞘再生，防止免疫损害。EGb761对EAE动物发挥着积极的作用，不但明显延长了EAE大鼠发病的时间，并且明显减轻EAE大鼠的病情严重程度。

有研究指出[5]，脊髓损伤后，组织学表现为脊髓组织出血、水肿、坏死、轴突脱髓鞘改变以及炎症细胞浸润。EGb腹腔注射后上述指标明显改善，脊髓组织空泡变性范围减小，炎症反应较轻，神经元变性坏死减轻。这些结果提示EGb 可能通过改善血液流变学指标和抑制脂质过氧化反应而发挥脊髓保护作用。黄镇[6]等在研究中证实，EGb中的有效成分银杏内酯，具有类似于脑源性神经营养因子(BDN F)促进胚基底前脑胆碱能神经元发育的作用。进一步研究发现，银杏内酯B 还具有类似BDN F 诱导神经干细胞分化为神经元的作用。EGb对CNS 神经干细胞向神经元分化的促进作用为：增加某些神经递质受体的数量，对神经元调亡具有保护作用。EGb [7]具有增强神经细胞活性，保护神经细胞染色体，由此将延长细胞的存活时间。

脱髓鞘疾病的损害引起神经元髓鞘脱失，影响运动机能，最大限度的保护神经髓鞘，寻找有效的髓鞘再生的方法，是脱髓鞘疾病不断研究的重点及热点。本实验结果显示，银杏叶提取物EGb761是一种相对于激素，干扰素，丙种球蛋白等副作用少，安全性高，可靠性强的药物。我国银杏叶约占世界分布的70%，有着广泛的应用前景，对于我国的医药卫生事业有积极的作用。

参考文献

[1] 周璟,张家胜,马宝骊,等.实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠模型的建立[J].上海第二医科大学学报.2002,22(1):16-19.

[2] Loffler T, Lee SK, Noldner M, et al. Effect of Ginkgo biloba extract (EGB761)on glucose metabolise related markers in streptczotocindamaged rat brain [J].J Neural Transm,.2001,108(12):1457-1474.

[3] Le-Bars PL,Velasco FM, Ferguson JM, et al. Influence of the severityof cognitive impairment on the effect of the Ginkgo biloba extractEGb761 in Alzheimer’s disease[J].Neuropsychobiology,2002,45(1):19-26.

[4] Chandrasekaran K, Mehrabian Z, Spinnewyn B, et al. Neuroprotective effects of bilobalide, a compoonent of the Ginkgo biloba extract (EGB761) in gerbil global brain ischemia[J].Brain Res.2001,922(2):282-292.

[5] 彭昊,张忠礼.银杏叶提取物对实验性脊髓损伤的保护作用[J].中国临床康复,2005,9(2):134-135.

[6] Huang Z, Jin G H, Zhang X H, et al. The inducing effects of ginkgo lide Bon neural stem cells differentiating into neurons[J].A cta A natom S in (解剖学报).2003,8(4):367-371.

[7] 李晓涛,宋运久,李艳君.EGB 对大鼠神经干细胞分化为星形胶质样细胞的影响[J].黑龙江医药科学,2006,29(4):4-5.