肠道病毒71型疫苗的中和抗体应答研究

　　肠道病毒1型EV1主要引起手足口病(HFMD)，近年来在我国呈现发病率高、重症和病死人数多的流行特征[1-3]，自2008年被纳人丙类传染病监控系统至2011年末，发病人数累计已达503.9万例，其中死亡1893人，已成为我国严重的公共卫生问题之一。由于缺乏特效的预防及治疗手段，研制出安全、有效的EV71疫苗已成为我国卫生系统的重要任务和挑战。目前，我国已有多家企业和科研单位开展了EV71疫苗的研发，其中3家企业已完成临床前研究进人临床试验阶段5。为了解不同企业研发EV71疫苗的免疫原性，对不同企业的疫苗原液和成品疫苗进行动物免疫原性进行比较，结果如下。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1EV71疫苗原液3批疫苗原液(编号:Y1,Y2,Y3)均为全病毒灭活疫苗原液，分别由A,B,C3家企业采用各自的疫苗生产病毒株(均为C4基因型)按各自的生产工艺制备。3批原液HPLC纯度均为95%以上;根据EV71抗原标准品(1600L·mL)用双平行线法检测EV71抗原含量在3240-21835U·mL之间。根据EV71抗原含量，采用生理盐水稀释至相同EV71抗原含量(860U·mL)后备用。　　1.1.2EV71成品疫苗(申报剂量)3批成品疫苗(编号:M玖M入M3)，分别为A,B,C企业由Y玖Y孰Y3批疫苗原液加适量氢氧化铝制备，EV71抗原含量在324一1012U·mL之间。　　1.1.3EV71成品疫苗(相同抗原含量)根据M1,M2,M3的EV71抗原含量，采用含铝稀释液稀释至相同EV71抗原含量(324U·mL)，得到3批抗原含量相同的疫苗戈编号:M1一M2一1,M3一1)。　　1.1.4动物清洁级ICR小鼠，6-8周龄，18-20g，雌性，购自北京维通丽华实验动物技术有限公司。　　1.1.5质控品EV71中和抗体标准品(定值标准品:1000U·mL，以及3份质控标准品，用于中和抗体检测质控)和EV71抗原标准品(1600U·mL，用于EV71疫苗原液的抗原含量测定)，均由中国食品药品检定研究院提供。　　1.2方法　　1.2.1动物免疫3批相同含量的EV71疫苗原液(Y1,Y2,Y3),3批相同含量的EV71疫苗(M1一1,M2一1,M3一1)和3批申报剂量EV71疫苗，分别腹腔注射免疫小鼠，每只。.5mL，每组30只，实验设相应稀释液为阴性对照组，且所有试验动物均进行完全随机分组二初免3周采血，初次采血2d后各组均采用相应抗原加强免疫1针，加免7d处死采血，分离血清，-20℃冷冻备检。　　1.2.2EV71中和抗体检测采用经典微量细胞病变法检测EV71中和抗体效价「6-7]。血清样本1:8稀释后，56℃灭活30min。待检血清从1:8开始2倍系列稀释，分别与100CCIDS。的EV71病毒等体积混合，于96孔板中置37℃中和2h后，加人横纹肌肉瘤细胞(简称RD细胞，由北京生物制品研究所惠赠)悬液(细胞终浓度为1一2x10个·mL)。至COZ培养箱于35℃下孵育7d，显微镜下观察细胞病变、以能抑制50%细胞病变的最高稀释度的倒数作为中和效价。每块细胞培养板均设细胞对照、血清对照和病毒对照，实验设病毒回滴作为质控(回滴结果在32一320CCIDS}/孔时，实验成立)，中和抗体检测方法预先分别经EV71和(}A16参比血清检测，证明无交叉反应。检测结果以中和抗体效价)1:8判断为EV71和中和抗体阳性;中和抗体效价<l:8判断为阴性。　　1.3统计方法　　EV71中和抗体阳性率比较采用X2检验。原始数据进行常用对数转换后计算抗体几何平均滴度(GMTs)和RSD，应用Sl'SS30软件分析。中和抗体阴性以1:4计算GMTso2结果2.1EV71疫苗原液的免疫原性由表1和表2可见，相同抗原含量(430I}:0.5mL)的3批原液免疫1针后，抗体阳性率在83.3%一90.0%之间，抗体效价在1:34.9一1:45.9之间，抗体阳性率与效价结果较一致。2针免疫后，中和阳性率均达100%，抗体效价升高至1:139.4一1:2$5.7,3批原液间均无显著性差异(P>0.05)。表明相同抗原含量的疫苗原液免疫小鼠诱导的中和抗体应答基本一致。　　2.2EV71疫苗的免疫原性(相同抗原含量)由表3和表4可见，免疫剂量均为162U/0._5mL/只的3批疫苗，1针和2针免疫后中和抗体阳性率分别为76.7%一83.3%和1000ho1针后抗体效价为1:33.0一1:53.6,3批原液间均无显著性差异(P>0.O5),2针后中和抗体效价分别为1:111.3,1:97.9和1:357.3,M3一1批显著高于M1一1和M2一1批(P分别为0.004和0.001)。　　2.3EV71疫苗的免疫原性(申报剂量)3批临床申报剂量(162,493,506U/0.5mL)疫苗，免疫中和抗体阳性率(1针为80%一100%,2针均为100%)以及1针抗体效价(1:46.8一1:115.4)均无显著性差异。2针后中和抗体效价分别为1:316.8,1:506.0和1:958.2,M3一1批疫苗显著高于M1一1批疫苗的中和效价(P为0.017)o3讨论3.1免疫原性是EV71全病毒灭活疫苗研发成功的关键之一，我国大陆申请EV71疫苗临床试验的3家企业均采用全病毒灭活工艺，但在毒株、细胞基质、生产工艺以及成品剂量单位上存在差异，该差异是否会导致病毒的保护性位点或空间构像产生差异，从而影响疫苗的免疫原性和效果目前尚不清楚。准确评价不同企业疫苗的免疫原性，对EV71临床试验的开展和评价具有重要意义。　　3.2EV71中和抗体检测和抗原定量检测的标准化是EV71疫苗研发的瓶颈之一，为保证疫苗中和抗体检测结果准确可比，在本次研究中应用了已建立的EV71中和抗体标准品和EV71抗原标准品，中和抗体检测时均应用质控品，在确定试验成立的基础上判定结果，保证结果的准确性;应用抗原标准品标化、统一原液和成品疫苗的抗原含量，在剂量一致的基础上免疫动物，保证结果的可比性。　　3.3国内外多项研究均证实EV71中和抗体对EV7I病毒的攻击具有保护和阻断作用。2007年Fo。等采用1:32的中和抗体血清腹腔注射乳鼠，可保护80%乳鼠免受致死量EV71的攻击。本研究结果显示，我国3家企业采用不同毒株、不同工艺制备的EV71灭活疫苗具有较好的免疫原性，162L'1针免疫即可诱导小鼠产生大于1:32的中和抗体水平，2针后抗体效价可达1:97.9一1:357.3，约是乳鼠保护水平的3一11倍,3家企业疫苗比较，1针中和抗体均无显著性差异，而2针后不同企业疫苗中和抗体应答不同，提示临床试验中不同企业疫苗进行2或3针免疫后可能存在中和抗体效价差异，因此在临床试验中需比较不同企业疫苗按不同程序接种后中和抗体应答的水平，同时进一步分析不同企业疫苗诱导的中和抗体水平与EV71感染或临床发病的关联是否存在差异，获得各企业疫苗的人群保护效果。　　3.4目前，国内外尚无不同企业EV71疫苗免疫原性的比较研究报道。本次研究应用抗原标准品标化、统一免疫剂量，获得了3家企业申报临床试验疫苗的原液和成品疫苗免疫原性比较资料，为EV71疫苗临床试验免疫效果的研究奠定了基础。　　参考文献1 Li L,He Y,Yang H, et al.Genetic characteristics of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen,People's Republic of China.J Clin Microbiol,2005,43(8):38352 Zhang Y,Tan XJ,Wang HY,et al.An outbreak of hand,foot,and mouth disease associated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong,China.J Clin Virol,2009,44(4):2623 YAO Xin(姚欣),MAO Qun-ying(毛群颖),HUANG Wei-jin(黄维金),et al. Genetic characterization of enterovirus 71 complete genome isolated in Beijing,2008(肠道病毒71 型北京分离株全基因组序列分析).Chin J Epidemiol(中华流行病学杂志),2009,30(7):724 National notifiable diseases announced by Ministry of Health of the People's Republic of China.[2012-02-16].http://www.moh.gov.cn/publicfiles//business/htmlfiles/wsb/pyqxx/list.htm5 Lee MS,Chang LY.Development of enterovirus 71 vaccines.Exerpt Rev Vaccines,2010,9(2):1496 Grandien M,Fosgren M,Ehrnet A,et al.Diagnostic Procedures for Viral,Rickettsial and Chlamydial Infections.7th ed.Washington,DC:American Public Health Association,1995.2797 Yin-Murphy M,Tan KL,Lim GN,et al.Poliovirus neutralizing antibody in infants and cord blood.Ann Acad Med Singapore,1993,22(3):281