LC-MS/MS法测定人血浆中的凡德他尼
发表时间：2014-03-10 浏览次数：986次
凡德他尼(Zactima,ZD6474)是一种口服的多通道肿瘤信号传导抑制剂,近年来在肿瘤治疗和药物开发方面受到广泛关注。临床前和临床研究表明,凡德他尼作为小分子的苯胺喹唑啉化合物,可同时抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR-2/KDR)、肿瘤细胞表皮生长因子受体(EGFR)和酪氨酸激酶原癌基因(RET)[1]。近期进行的Ⅱ期临床研究资料表明,EGFR和VEG-FR双通道阻止剂凡德他尼对晚期非小细胞肺癌(NSCLC)、晚期多发性骨髓瘤、晚期乳腺癌及甲状腺癌等的治疗可能具有较好的疗效和应用前景[2]。为研究凡德他尼在中国人体中的药代动力学规律,本实验建立了人体血浆中高效液相色谱-质谱测定法[3],本法测定线性范围宽,灵敏度高,分析时间短,适合血药浓度测定及其药代动力学、生物利用度研究。
材料、对象与方法
1 药品与仪器
凡德他尼,规格:每瓶5O mg,批号:02OOO078719,英国Aacclesfield Cheshire公司生产;[13C,d3]-ZD6474内标对照品,含量:95.4%,规格:每瓶20mg,批号:ISI,Astra Zeneca公司合成提供。
API2000三级四极杆质谱检测仪,美国AB公司产品;1200高效液相色谱仪,美国安捷伦公司产品。
2 受试者选择
选取2O06年8月至2007年3月在中山大学肿瘤防治中心内科就诊的6名组织学或细胞学已确诊的中国籍恶性肿瘤患者,注射100mg·m-2凡德他尼。年龄30~82岁;身高:152~4425px;体重:50~76kg,体重指数(BMI)17.6~28.6kg·m-2。受试者均签署知情同意书。试验方案经中山大学肿瘤防治中心伦理委员会批准。
3 测定条件
色谱条件 色谱柱:Intersil ODS-3RP18柱(2.1 mm×150mm,3um);流动相:0.02mol·L-1乙酸铵缓冲液(pH=3)-乙腈(70:30);流速:0.2mL·min -l;进样量:50uL。
质谱条件 ESI离子源;多反应离子监测(MRM);正离子检测;离子源温度:475℃;气帘气(CUR):30eV;喷射电压(IS):55OOV;离子源气体1(GAS1):6OkPa;离子源气体2(GAS2):70kPa;去簇电压(DP):70eV;聚焦电压(FP):400cV;进人电压(EP):10eV;碰撞电能(CE):48eV。离子对凡德他尼的[M+H]+:475.1/112.0;[13C,d3]-凡德他尼的[M+H]+:479.1/116.0。
4 血样本处理
取凡德他尼血浆200uL,加人0.1mol·L-1Na0H和50ng·mL-1[13C,d3]-凡德他尼内标2O0 uL,混匀待测。加人甲基-叔丁基一醚3.5mL,混合均匀2min,2000r·min离心2min分层,收集醚层溶液,40℃氮气吹干。用流动相200uL复溶,2O00 r·min-1离心5min,取上清液10uL进样。
5 对照品溶液的配置
称取凡德他尼对照品2.5mg,用乙腈定容,得浓度为100ug·mL I溶液,储存于4℃冰箱,使用前用空白血浆稀释得到浓度不同的凡德他尼模拟血浆样品。
结果
1 专属性
内标标准液加人空白血浆中;凡德他尼和内标标准液加入空白血浆中;取受试者给药后收集的血浆样品,见色谱图1。结果表明,凡德他尼和内标的保留时间分别为5.10,4.89min,空白血浆中内源性物质不干扰凡德他尼及其内标的测定。
2 标准曲线和定量下限
取凡德他尼对照品储备液适量,加人空白血浆,稀释成5,10,25,100,250,500,10OO ng·mL-l的血浆标准曲线样品,加人内标溶液200uL,按“血样本处理”操作,以待测样品与内标子离子质谱峰面积比值为纵坐标(D,浓度为横坐标(X),进行线性回归(权重1/'),得标准曲线y=1.53Xi+5.31×102(r=0.9990)。线性范围为5~1000ng.mL-1,定量下限为5ng·mL-1。
3 精密度和回收率
低、中、高(15.0,5O0.0,8O0.0ng·mL-1)浓度质控样品,按“血样本处理”操作,以药物的峰面积在标准曲线上求出凡德他尼浓度,每浓度6份,连续测定4批,计算批内和批间RSD。按“血样本处理”操作含对照品或内标的血浆,进样所得的峰面积比对照品溶液直接进样所得峰面积,计算绝对回收率,见表1。
4 稳定性
考察血浆样品提取后在室温放置5d,56℃下放置1h,样品-80℃冻融3次的稳定性,结果表明样品基本稳定,RSD<10%。
5 基质效应
把空白血浆按“血样本处理”操作,所得的提取液为溶剂,加入低、中、高(15.0,5O0.0,8O0.0ng·mL-1)浓度质控样品,进样分析,得峰面积A1;以流动相为溶剂,加人浓溶液配制而成的相应浓度的纯标准品进样分析,得峰面积A2。结果显示,其ME平均值为91.4%~94.3%,本试验方法学不受基质效应的干扰。
6 方法学应用
6名确诊的中国籍恶性肿瘤患者注射100mg·m2凡德他尼,药物浓度-时间曲线表现为双指数曲线特征,滴注结束即刻的血浆药物浓度最高,为(416.16±71.23)ng·mL1。凡德他尼在血浆中消除缓慢,消除相浓度的对数值对时间作图为一直线。
本研究用LC-MS/MS法测定人血浆中凡德他尼的血药浓度,专属性好,灵敏度高,血浆样本检测的线性、精密度、回收率、稳定性等指标均符合生物样品分析要求。实验结果表明,本方法简便可靠,能较好的用于凡德他尼的药代动力学研究。
本研究为6例中国恶性肿瘤患者注射100mg·m2凡德他尼的药代动力学研究,结果显示,凡德他尼给药后的停药即刻血浆药物浓度最高,随即快速降低,然后进人缓慢消除阶段。其在血浆中的清除缓慢,半衰期较长,表观分布容积较大,主要药代动力学参数与国外报道结果相似[4]。
参考文献
[1]Miller KD,Trigo JM,Wheeter C. A multicenter phase Ⅱ trial of Vandetanib,a vascμLar endothelial growth factor receptor-2 and epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,in patients with previously treated metastatic breast cancer[J].Clinical Cancer Research,2005.3369-3376.
[2]李勇,张湘茹,孙燕. 多靶点抗肿瘤新药:凡德他尼[J].癌症进展,2006.206-211.
[3]Zirrolli JA,Bradshaw EL,Long ME. Rapid and sensitive LC/MS/MS analysis of the novel tyrosine kinase inhibitor ZD6474 in mouse plasma and tissues[J].J Pharm Bioml Anal,2005.705-711.
[4]Zhang L,Li S,Zhang Y. Pharmacokinetics and tolerability of vandetanib in Chinese patients with solid,malignant tumors:an open-label,phase I,rising multiple-dose study[J].Clinl Ther,2011.315-327.
