苏拉明对小鼠肺腺癌的抑制作用及对血清VEGF和MMP-9表达的影响

近年来，由于城市工业化、农村城镇化、环境污染的加速，特别是烟民的增加，肺癌的发病率及死亡率都明显升高，而肺腺癌血管丰富，生长快，转移早，预后极差，是预后最差的恶性肿瘤之一。血清中细胞因子检测在非小细胞肺癌（Non-small cell lung carcinoma，NSCLC）的研究中越来越受到人们的注意，细胞因子的检测能有效地监测疗效和评价肿瘤的生长与转移,同时以抗血管为靶点的抗肿瘤治疗亦成为研究热点。苏拉明是一种合成的六萘酸脲阴离子化合物,既往的研究表明他对肺腺癌生长有明显的抑制作用［1］，但具体的作用机制尚不十分清楚，本研究笔者构建肺腺癌小鼠移植瘤模型，以DDP为阳性对照，观察苏拉明对肺腺癌移植瘤生长和转移的影响，通过检测血清中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和基质金属蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)的表达以探讨其抗瘤机制。现报告如下。　　　　

1材料与方法

1.1实验动物、细胞株、药品及试剂：C57BL/6J小鼠24只，雌雄各半，体重(20±2)g，购自中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心，许可证号：SCXK11-00-0005，由南华大学肿瘤研究所提供SPF级饲养环境。Lewis肺癌（鼠源）由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供，顺铂购于江苏豪森药业股份有限公司（生产批号:040605），苏拉明购于美国Sigma公司，小鼠VEGF酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒为美国Bio Sources公司产品,小鼠MMP-9 ELISA试剂盒为美国R＆D system公司产品。

1.2动物模型的建立：处死两只荷瘤种鼠(接种Lewis肺癌（鼠源）细胞)，无菌条件下剥离皮下瘤体，剪去瘤体表面的血管、结缔组织以及内部坏死组织，使用NaCl溶液冲洗，剪碎后放入匀浆器，研磨瘤组织成为细胞悬液，滴加NaCl溶液调节细胞密度至1×107/ml，各小鼠右腋下接种0.2 ml细胞悬液(含细胞数目2×106个)形成小鼠动物肿瘤模型。

1.3分组及用药：24只小鼠皮下移植处均成瘤，接种后第4天开始药物干预。将24只C57BL/6J小鼠随机分为三组：荷瘤对照组、顺铂组、苏拉明组。每组8只，雌雄各半。对照组，NaCl溶液0.2 ml/只腹腔注射（ip），1次/d；顺铂组,顺铂4 mg/（kg·d）溶于NaCl溶液0.2 ml中ip，于接种后第4天、第11天、第18天各1次，并予NaCl溶液0.2 ml/只每天腹腔注射1次；苏拉明组，苏拉明10 mg/（kg·d）溶于NaCl溶液0.2 ml中ip，1次/d，肿瘤接种24天处死全部小鼠。

1.4观察指标及方法

1.4.1肿瘤生长的观察：用药期间每隔2天用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤最大长径（a）和横径（b），计算肿瘤体积，平均瘤体积=a×b2/2。肿瘤接种24天处死全部小鼠，剥离皮下肿瘤称重，计算各组药物的抑瘤率，抑瘤率=（对照组瘤重-实验组瘤重）/对照组瘤重×100%。

1.4.2肿瘤转移的观察：实验结束后，剖胸观察双肺表面肿瘤转移情况，将肺脏浸泡于Boins液（4%中性甲醛溶液占70%，冰醋酸占5%，苦味酸过饱和液占25%）24 h，待肺转移瘤结节突起后计数肺部表面转移结节数，计算肺表面结节转移抑制率：转移抑制率(%)=（1-用药组平均转移结节数/对照组平均转移结节数）×100%。

1.4.3VEGF及MMP-9的检测：用酶联免疫吸附法（En zyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测VEGF及MPP-9，将经眼球静脉丛取出的各组小鼠血液样本1 ml经4℃保存过夜后10 000×g离心10 min，收集上清(血清)，采用小鼠ELISA试剂盒测定各组小鼠血清VEGF、MMP-9表达情况，具体检测方法严格参照试剂盒说明书进行，在450 nm处读取吸光度值，VEGF、MPP-9的测定分别按照试剂盒提供的标准试剂所得到的标准曲线进行测定，计算出各检测孔中VEGF（pg/ml）、MPP-9(ng/ml)的浓度值。

1.5统计学处理：计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,根据数据类型分别使用组间t检验，χ2检验，用最小显著性差异法分析每两组之间的差异，用SPSS 17.0软件进行统计学处理，以P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。　　　　

2结果

2.1肿瘤生长情况：肿瘤接种后的第1~4天，接种处成瘤率为100%，移植瘤生长基本相同，各组皮下移植瘤的体积逐渐增大，成局部结节状生长，后期18~24天，对照组移植瘤生长明显快于其他组，苏拉明组肿瘤生长最慢，处死后解剖观察见肿瘤质硬，表面有血管生长分布，以对照组明显，各用药组对移植瘤生长均有抑制作用。各组肿瘤体积，质量及抑瘤率见表1，各组肿瘤见图1。　　　　

2.2肿瘤转移情况：肺转移结节数：各用药组均明显低于对照组，差异有统计学意义,苏拉明组肺转移结节明显减少(P<0.01)，小鼠肺转移发生率：苏拉明组8只小鼠中有6只发生转移，低于对照组和DDP组（8只全部转移），转移抑制率的比较：苏拉明组与其他各组比较转移抑制率明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，肺湿重比较随转移结节数减少而降低，苏拉明组与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)，转移情况见表2，肺转移结节见图2。

2.3血清VEGF及MMP-9检测：对照组和DDP组血清VEGF的表达为强阳性，苏拉明组同对照组及DDP组相比VEGF表达减小(P<0.01),所有各组血清MPP-9均阳性表达，苏拉明组与对照组和DDP组相比较，MMP-9的表达明显减少(P<0.01)；而DDP组与对照组相比差异无统计学意义，各组VEGF和MPP-9表达见表3。　　　　

3讨论

目前，中晚期肺癌患者的预后仍然很差，Ⅱ～Ⅳ期患者的5年生存率仅在15％左右［2］。肺癌患者的预后和临床分期紧密相关，由于肺癌的临床表现缺乏特异性，多数肺癌患者在确诊时已经是中晚期，从而失去了外科手术机会，放化疗为其综合治疗的主要方法,而新近对恶性肿瘤的治疗目标转移到控制肿瘤血管的生成，从而抑制其生长和转移［3］。肺腺癌作为肺癌的一种组织学类型其发病率在迅速上升,该类肺癌癌瘤内血管丰富、生长快、手术机会少、预后极差，寻找与肺腺癌进展相关的指标对肺腺癌的靶向治疗有重要意义，已成为国内外学者研究的热点，开发抑制其生长和转移的药物已成为一项重要课题。血液肿瘤标志物具有检测方便、易于重复的特点，对判断肿瘤的进展及预后具有重要的意义，近年来苏拉明抗肿瘤作用逐渐受到瞩目［1，4-5］，本课题观察苏拉明对肺腺癌生长和转移的抑制作用及通过检测血清VEGF和MMP-9的表达探讨及抗肿瘤机理。

肿瘤的生长、浸润及转移是一个复杂的过程，离不开新生血管和淋巴管生成，研究已经证实［6-7］，肿瘤的生长及转移早期即需要血管生成，以满足肿瘤生长所需要的营养，在大多实体肿瘤中，都存在异常的血管生成。VEGF是一种多功能糖蛋白，是体内最强、特异性最高的一种血管生长因子，是刺激血管内皮细胞增殖和移行的重要因子，也是已知最强的血管通透剂，通过增加血管内皮细胞的有丝分裂和促使血管内皮细胞的迁移，促使病理性血管生成，而肿瘤血管的生成有利于肿瘤细胞浸润淋巴管，促进肿瘤向淋巴结转移，由于VEGF特异性地作用于血管内皮细胞，参与实体瘤的血管新生，与实体瘤的侵袭和转移等生物学特性密切相关［8］。近年来，血清中细胞因子检测在非小细胞肺癌的研究中越来越受到人们的注意，随着肿瘤的发展，恶性肿瘤细胞常常分泌大量的细胞因子，造成恶性肿瘤的异常增殖,细胞因子的检测能有效地监测疗效和预防复发，酶联免疫法在NSCLC患者血清中蛋白水平的测定有可能替代肿瘤组织中mRNA的检测，为那些无法取得肿瘤组织或取到肿瘤组织较困难的患者提供更快捷、简便的检测方法，为临床选择治疗方法及判断预后提供依据，血清VEGF浓度水平能够反映癌组织VEGF的表达情况，认为检测血清中VEGF的水平可反映恶性肿瘤血管生成的活性程度，可作为判断肺癌患者预后的独立指标,对判断肿瘤生长及转移、肿瘤负荷、治疗反应及预后等有一定的临床指导意义［9］。本研究中，对照组血清中VEGF表达明显升高，其血清浓度高达（431.15±27.38）pg/ml，而其肿瘤生长快，肺内转移结节多，使用药物干预后，在顺铂组中，血清VEGF表达略有下降，肿瘤生长受到抑制，肿瘤转移亦受到抑制，但对肿瘤转移的抑制作用较轻，而苏拉明能明显下调肺腺癌小鼠血清VEGF的表达，其浓度下降至（135.35±19.05）pg/ml，肿瘤的生长和转移都受到明显的抑制，其抑瘤率为49.11，而肺表面转移结节数为6.00±1.70，较对照组（14.00±2.90）和顺铂组（9.77±1.65）都明显下降，肿瘤转移抑制率为57.15，较顺铂组（30.25）明显升高，说明苏拉明可能能通过下调肺腺癌小鼠血清VEGF的表达，抑制肿瘤的血管生成，从而抑制肿瘤的生长和转移，我们既往的研究亦表明苏拉明能下调肺腺癌肿瘤组织内VEGF的表达［10］，与本研究的结果一致，顺铂作为肺癌的一线化疗药物，亦能抑制肺癌的生长和转移，但对转移的抑制作用较弱，可能与顺铂主要为细胞毒作用有关。在肿瘤的发生及发展的各个环节中，都伴有多种肿瘤侵袭及转移相关基因的表达异常，这可能是细胞恶变过程中获得侵袭和转移能力的重要原因，而肿瘤的侵袭和转移的关键是基底膜的破坏和细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的降解，肿瘤细胞从原发灶脱落后，必须突破ECM和基底膜组成的屏障结构，才能向周围组织侵袭，从而进入血液循环或淋巴系统，形成远隔器官转移或淋巴结转移［11］。恶性肿瘤细胞能产生多种蛋白水解酶，基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是一种重要的蛋白水解酶家族，他是一类锌离子依赖性肽链内切酶，其成员超过24种，通过降解细胞外基质(Extracelular matrix，ECM)及基底膜(Basement membrane，BM)在肿瘤生长、浸润及转移中起重要作用［11-12］。其中MMP-9是目前发现的与肿瘤侵袭关系最为密切的一种基质金属蛋白酶,在病理情况下，他能够降解构成基底膜主要支架的Ⅳ型胶原和包绕肿瘤的基质及一些非基质成分，为其生长及转移提供空间及通道，改变肿瘤细胞的微环境，突破组织基质屏障，促进肿瘤的侵袭和转移［13-14］；本研究中，对照组肺腺癌小鼠血清中MMP-9呈高表达状态，肿瘤转移率明显增加，肺转移结节数最多，为14.00±2.90，经苏拉明干预后，MMP-9的表达明显下调，与对照组及顺铂组皆有显著性差异，而肿瘤的转移亦受到明显抑制，转移结节数为（6.00±1.70），转移抑制率高达57.15%，与其他两组比较差异有统计学意义，提示苏拉明可能通过下调MMP-9的表达阻止了肿瘤的侵袭和转移。当然肿瘤的生长、侵袭和转移是一个多步骤、多因素作用的结果，有研究表明MMP-9另一方面能通过促进VEGF的释放参与调节毛细血管增生和促进新生血管生成，促进肿瘤的生长和扩散［15］。

综上所述，苏拉明对小鼠肺腺癌的生长和转移有明显抑制作用，其作用机制可能通过下调VEGF和MMP-9的表达，抑制肿瘤新生血管形成，阻止基底膜的降解，从而抑制肿瘤的生长、侵袭和转移。笔者选择血清学指标可能与肿瘤组织中相应蛋白表达一致，具有取材容易，检测方便，便于重复等优点，将受到人们的关注。鉴于肿瘤的发病机制极为复杂，对于苏拉明抗瘤作用更为详尽的机制有待进一步研究。

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