生长激素释放肽对心衰大鼠植物神经重构的影响

生长激素释放肽对心衰大鼠植物神经重构的影响 冯佳1田国忠1*赵勇1李艳君1钟震亚1倪秀芹2 （1佳木斯大学基础医学院局部解剖学教研室， 佳木斯 154007, 2哈尔滨医科大学大庆校区解剖学教研室， 哈尔滨 163000）  摘要:本研究观察了生长激素释放肽(GHRP)的应用对心衰动物胆碱能神经和肾上腺素能神经支配的影响。Wistar大鼠50只，随机分为：假手术组10只；GHRP组30只；模型组10只。心衰模型成功后4周，KarnovskyRoots法及免疫组织化学方法分别显示心肌胆碱能神经纤维及肾上腺素能免疫阳性纤维，应用多功能真彩色病理图像分析系统分析两种神经纤维密度。结果显示，模型组大鼠心肌中胆碱能神经纤维和肾上腺素能神经纤维密度明显低于假手术组（P<0.01）；GHRP组大鼠心肌中两种神经纤维密度较模型组明显增高（P<0.01），但略低于假手术组神经纤维密度（P<0.05）。上述研究表明GHRP可延缓大鼠心衰后的去神经支配，改善神经重构。  关键词 心衰胆碱能神经纤维肾上腺素能神经纤维GHRP  Effect of growth hormonereleasing peptide on autonomic  nerves&rsquo; reconstitution after rat heart failureFeng Jia1, Tian Guozhong1, Zhao Yong1, Li Yanjun1,  Zhong Zhenya1, Ni Xiuqin2 (1Department of Anatomy, The Basic Premed of Jiamusi University, Jiamusi 154007;  2Department of Anatomy, The Daqing Branch of Harbin Medical University, Daqing 163100)  AbstractWe observed the effect of growth hormonereleasing peptide (GHRP) on cholinergic nerve fibers and adrenergic nerve fibers after heart failure. Fifty Wistar rats were divided into 3 groups: the false surgery group (n=10); GHRP group (n=30); model group (n=10). The samples were collected 4 weeks after heart failure and then the cholinergic nerve fibers were labeled with KarnovskyRoots method; the adrenergic nerve fibers were stained with immunohistochemistry. The densities of those two nerve fibers were analyzed by using the analysis of multifunction color pathological image system. The results showed that the densities of cholinergic nerve fibers and adrenergic nerve fibers in the model group were obviously lower than that in the false surgery group (P<0.01); the densities of those two nerve fibers in the GHRP group were higher than that in the model group (P<0.01), but a bit lower than that of the false surgery group (P<0.05). These results suggest that GHRP can delay the denervation and ameliorate the nerve reconstitution of heart failure in rats.  Key wordsheart failure, cholinergic nerve fibers, adrenergic nerve fibers, GHRP  随着心血管疾患发病率逐年上升，慢性心力衰竭（chronic heart failure, CHF）的出现率也随之攀升，其发生率和死亡率很高，是大多数原发性心血管疾病的最终归宿。近年发现许多心脏疾病伴有植物神经分布密度改变的现象(神经重构)，这种神经分布异常与心律失常发生、疾病预后都有密切的关联［1, 2］。因此，在心衰早期应用神经保护药物，有可能减少或延迟神经的变性和坏死，促进神经的再生和功能恢复，从而缓解心衰后植物神经的去支配。生长激素释放肽(growth hormonereleasing peptide, GHRP)在中枢及外周组织都具有广泛的生物学活性，可直接参与心脏局部神经体液调控。已有研究证实GHRP改善心衰局部的去甲肾上腺素（NE）水平［3］，但对于心衰后植物神经去支配的影响，目前尚未见报道。本研究应用酶组织化学和免疫组织化学技术，观察心肌中胆碱能神经纤维和肾上腺素能神经纤维的分布密度，并比较各组间差异，探讨GHRP对心梗后心衰大鼠神经重构的影响。  材料和方法1.心梗模型 参照文献［4］的方法，并有所改良，采用结扎大鼠冠状动脉前降支法造成心肌梗死，而后形成慢性充血性心力衰竭模型。实验用健康、成年Wistar大鼠70只（哈尔滨医科大学动物室提供），体重(200&plusmn;20) g，以0.5%戊巴比妥钠溶液0.6~0.8 ml/100 g腹腔注射麻醉，仰卧位固定，胸部备皮。各组均于开胸前描记肢体导联心电图，随后接小动物呼吸机，在胸骨左缘0.5 cm处作纵切口，钝性分离胸肌，轻压右胸，挤出心脏，于肺动脉圆锥与左心耳之间，用50缝合线结扎左冠状动脉前降支，将心脏迅速放回胸腔，闭合胸腔。假手术组只挤出心脏,不结扎。描记结扎后心电图，以Ⅰ、Ⅱ、AVL导联ST段弓背向上抬高为有急性前壁心肌梗塞形成的标志，即表明急性心肌梗死造模成功，否则弃之。术中用庆大霉素冲洗伤口，术后青霉素4万单位每只肌注3 d，预防感染。手术5周，用L400彩色超声心动仪进行心功能检测，根据文献报道，以EF值小于60%作为心衰模型成功的标志［5］。去除死亡和未达到心衰标准的大鼠后，随机分为：(1)GHRP组30只；(2)模型组10只；(3)假手术组10只。GHRP组按100 mg/kg（蒸馏水溶解）尾静脉注射GHRP2，每天一次；其余2组均尾静脉注射同等体积的生理盐水，每天一次。连续给药4周后取材。 2.取材与染色取材时，分别取各组大鼠左心室、右心室以及室间隔。组织块作冰冻切片，厚10 &mu;m，每隔10片取一片，其间取4 &mu;m切片5片，切后用纯丙酮固定1 min。取材前描记心电图。按酶组织化学KarnovskyRoots法配制孵育液［6］，其配方为碘化乙酰硫胆碱5 mg, 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.6）6.5 ml，0.1 mol/L枸橼酸钠0.5 ml，30 mol/L硫酸酮1 ml，4 mol/L异丙基焦磷酰胺0.2 ml，蒸馏水1 ml，5 mol/L铁氰化钾1 ml。将10 &mu;m切片浸入孵育液中，置于37℃温箱中孵育3 h。水洗、封片；采用免疫组织化学 SP法显示肾上腺素能阳性纤维，所用抗体为兔抗鼠TH多克隆抗体（1∶200），SP试剂盒和DAB显色剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供；将4 &mu;m的切片进行HE染色，作为镜下观察时的对照。 3.光镜观察和图像分析光镜观察心衰大鼠心肌中胆碱能神经纤维和肾上腺素能神经纤维的分布，应用CMIAS系列图像采集模块照像，多功能真彩色病理图像分析系统分析两种纤维分布密度（其工作原理是通过灰度分析来识别阳性纤维）。所得数据用&plusmn;s表示，应用SPSS11.5软件包进行统计学处理，多组间计量资料比较采用方差分析，P﹤0.05为差异有显著性。  结果  1.HE染色光镜下观察所见假手术组心肌细胞排列整齐（Fig. 1A），细胞纹理清晰，走形正常，胞浆着色均匀，间质细胞无增生，间质无扩张充血，无炎性细胞浸润。模型组心肌纤维着色不均（Fig. 1B），纹理消失，间质轻度水肿，灶性间质细胞增生，部分可见灶性心肌纤维走形中断，心肌细胞核萎缩、变性或溶解、消失，染色变深，且形成未着色的瘢痕区。GHRP组（Fig. 1C）心肌损害较模型组减轻，心肌纤维仅有轻度变性。 2.GHRP对CHF大鼠心肌中乙酰胆碱能神经纤维的影响假手术组心肌纤维排列密集，于心肌纤维间沿长轴走行着棕褐色的胆碱能神经纤维（Fig. 1D）；模型组胆碱能神经纤维明显减少（P<0.01），且较短小，虽然还能见到胆碱能神经阳性纤维分布的区域，但区分已不十分明显（Fig. 1E）；GHRP组（Fig. 1F）胆碱能阳性神经纤维，与模型组比较明显增多（P<0.01），但仍比假手术组少（表1）。 2.GHRP对CHF大鼠心肌中肾上腺素能神经纤维的影响假手术组心肌细胞排列整齐有序，冠状血管的分支分布丰富，于心肌纤维间沿长轴分布着棕黄色点状或线状的肾上腺素能神经纤维，其中沿血管分布最多（Figs. 1G, H）。模型组肾上腺素能神经纤维明显减少（P<0.01），且多呈点状分布，几乎看不到完整的神经纤维（Fig. 1I）；GHRP组肾上腺素能神经阳性纤维，与模型组比较明显升高（P<0.01），但仍比假手术组少（Fig. 1J，表1）。讨论心力衰竭是一种复杂的临床症候群。心衰后, 心肌的肾上腺素能神经、胆碱能神经等的支配都会发生相应的改变。Kaye等［7］通过大量实验研究认为，在心肌细胞发生一系列变化的同时，心脏交感神经末梢的支配密度（innervation density）减少。这一结论和本实验结果基本一致：心梗后心衰心肌中肾上腺素能神经纤维和乙酰胆碱能神经纤维的密度比正常心肌明显下降（P<0.01），而心衰早期GHRP的应用，能减缓这两种神经纤维密度的减少（P<0.05），抑制其去神经支配，减轻心肌损伤后的神经重构。King等［8］应用猪的心衰模型发现心衰时血浆NE水平明显升高，为正常的10倍；Kaye等［7］证实心衰患者血浆神经生长因子（NGF）明显低于正常人，心衰大鼠心肌NGF mRNA表达亦较正常组显著减少，而将游离的心肌细胞暴露于富含NE培养液中也可使NGF mRNA及蛋白表达减少。故认为心肌NGF下调可能是心衰心肌细胞对交感神经过度活动的适应性反应，是导致心衰时心脏神经末梢支配密度减少的重要机制之一。本实验通过研究进一步发现，在心衰早期应用GHRP能有效的改善心脏的去神经支配，推测其作用可能是通过NGF途径实现的：大鼠心衰后，血浆中NE含量升高，导致心肌NGF mRNA及蛋白表达减少，因此心脏神经末梢密度减少；而现已证实GHRP的早期应用可降低心衰时NE的含量［8］，进而使心肌NGF mRNA及蛋白表达增加，促使心脏神经末梢支配密度增加。此外，GHRP能增加冠状动脉血流量［9］，有利于微循环的物质交换，给神经细胞提供充足的营养物质和氧气，从而阻止神经纤维的退变或消失。GHRP能促进神经细胞的有丝分裂和生长，促进心肌细胞生长代谢、损伤修复，并具有抗细胞凋亡的作用，促使心衰心肌细胞的变化逆转或改善［10］。GHRP能改善和缓解的这些变化正是衰竭心脏泵血功能衰退的基础，说明GHRP有可能成为一种改善衰竭心脏功能的良好辅助药物。GHRP的合成及其生理作用研究的历史不长，但进展迅速。本研究显示GHRP可明显改善心梗后心衰的神经重构，为GHRP应用于临床提供了形态学依据。若通过研究，将GHRP应用于临床心衰的生物学治疗中，使心脏神经重新达到一个合适的平衡状态，可能会对与神经重构密切相关的恶性心律失常及心源性猝死的发生起到更积极的作用。参考文献  ［ 1］ Qin F, Vulapalli RS, Stevens SY et al. 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