紫外分光光度法测定氨茶碱中毒方法的建立与应用

　　氨茶碱(Aminophylline)是一种常用药，临床应用广泛，尤其是治疗支气管哮喘患儿的常用药。由于氨茶碱的有效治疗剂量与中毒剂量非常接近，容易导致中毒而出现中毒症状。随着近年中国城市工业化的发展，环境污染日趋严重，哮喘尤其是小儿哮喘的发病率逐年增高，氨茶碱中毒的病例也随之越来越多。另外，有一部分患者是因情感纠葛、生气而自杀性地误服氨茶碱中毒[1]。临床上迫切需要快速检验氨茶碱中毒的方法，为临床急救提供诊断依据。作者根据自己实验室条件，参考文献[2-5]，建立了适用于氨茶碱中毒快速检验的双光束紫外分光光度法，应用于临床能够明确诊断是否氨茶碱中毒，并开展了氨茶碱血药浓度检测，对患者个体化用药有重要意义[6]。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料　50例氨茶碱中毒患者，女性38例，男性12例，均出现呕吐，烦躁不安，呼吸、心跳加快等中毒症状。健康人血清和中毒患者血清来源于医院急诊科。

　　1.2　检测原理　氨茶碱在0.1mol/L氢氧化钠溶液中，在(275±1)nm处有最大吸收峰，根据其吸收峰的吸光度大小与氨茶碱浓度成正比的特点计算其浓度。

　　1.3　仪器与试剂　UV-2600双光束紫外/可见分光光度计，50μL微量比色池(上海天美科学仪器有限公司)，LG16-B高速离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)，SK-1型快速混匀器(常州国华电器有限公司)。氨茶碱标准品(纯度99.0%，天津希思思生化科技有限公司)，三氯甲烷、异丙醇为分析纯。

　　1.4　方法　取带盖塑料试管标注V和B，V管加患者血清0.5mL，B管加健康人混合血清0.5mL，分别加0.1mol/L的盐酸溶液0.2mL，再加入三氯甲烷：异丙醇(95：5)的萃取液4.0mL。用SK-1型快速混匀器充分震荡萃取，静置5min，以8000r/min高速离心5min，取有机层分别于另一试管中，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液2.0mL反提，充分震荡，以8000r/min高速离心5min，取氢氧化钠层待用。设定扫描波长范围为200～400nm处，取0.1mol/L氢氧化钠溶液50μL于微量比色杯中做基线测量，然后扫描V和B管的氢氧化钠溶液层，氨茶碱最大吸收峰在(275±1)nm处。根据(275±1)nm处的最大吸收峰进行定性，查标准曲线或回归方程求出患者血清中氨茶碱浓度。

　　1.5　统计学处理　采用SPSS12.0软件进行统计学处理，以p<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结　　果

　　2.1　氨茶碱最大吸收峰　用0.1mol/L氢氧化钠溶液配制100μg/mL的氨茶碱标准贮备液。然后再用0.1mol/L氢氧化钠稀释氨茶碱贮备液，使其氨茶碱浓度为30、20、10μg/mL的标准应用液。以0.1mol/L氢氧化钠为空白做基线测量，分别对氨茶碱标准应用液进行扫描。结果氨茶碱在(275±1)nm处有最大吸收峰。因此确定(275±1)nm为氨茶碱检测波长，这与文献[3]报道相符。

　　2.2　空白试验　取健康人混合血清0.5mL，分别加入3个带塞塑料试管中，按本文1.4方法萃取血清样品。用其中1份50μL做基线扫描，然后扫描其他2份空白液。空白试验表明：健康人血清在220～400nm无吸收峰。

　　2.3　线性范围与检出限　用0.1mol/L氢氧化钠溶液精确配制100μg/mL的氨茶碱标准贮备液。取配制好的100μg/mL的氨茶碱标准贮备液，用健康人混合血清逐级稀释为0.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、80.0μg/mL的氨茶碱工作应用液，取0.5mL于7个带盖塑料试管中。分别加0.2mL的0.1mol/L盐酸溶液，再加萃取液4.0mL。下面步骤按方法按本文1.4操作进行。设定扫描波长范围为200～400nm，取0.1mol/L氢氧化钠溶液50μL于微量比色杯中做基线测量，然后扫描不同浓度的氨茶碱标准和空白管上层液(氢氧化钠溶液层)，氨茶碱最大吸收峰在(275±1)nm。按上述操作方法做5次平行试验，根据在(275±1)nm测定的平均吸光度值(犢)并对氨茶碱质量浓度(犡)进行回归，得线性回归方程Y=0.0101X+0.0065，相关系数(r)=0.9998，线性范围为5.0～60μg/mL，氨茶碱最低检出浓度为2.0μg/mL。

　　2.4　精密度试验　取健康人混合血清20.0mL，分别配制0.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL氨茶碱浓度血清样品，分别取其0.5mL于5支塑料试管中。其他操作按本文1.4操作进行。在同一日不同时间及不同日间按上述方法测定氨茶碱浓度(n=5)，计算日内日间相对偏差，结果见表1。

　　2.5　方法回收率试验　采用加入回收法，取健康人混合血清配制的氨茶碱浓度为5.0μg/mL的血清样品1.0mL，分别加入5.0、10.0、15.0、20.0、30.0μg氨茶碱标准品混匀，理论浓度值为10.0、15.0、20.0、25.0、35.0μg/mL，各取0.5mL于带盖塑料试管中，并取空白血清0.5mL作对照，按本文1.4操作进行(n=5)，求出回收率值。结果经统计学处理，其回收率为85.5%～102.4%，相对标准差(RSD)为3.5%～4.8%。

　　2.6　血清氨茶碱定量与血液透析　氨茶碱有效治疗浓度较小(5～20μg/mL)，个体差异大，当血药浓度低时，不能有效缓解哮喘，血药浓度高又会引起中毒症状，在临床上经常遇见氨茶碱中毒病例。本文统计50例氨茶碱中毒患者，血液氨茶碱透析前后浓度分别为(48.80±21.70)μg/mL和(7.62± 3.86)μg/mL，差异有统计学意义(p<0.05)。说明及时进行透析治疗是降低氨茶碱血药浓度，控制中毒症状发作的有效措施。

　　3　讨　　论目前测定氨茶碱血药浓度的方法包括高效液相色谱法(HPLC)、荧光偏振法(TDX)、均相酶免疫法等，但这些方法所需仪器昂贵，操作繁琐，当疑似氨茶碱中毒需要做出鉴别时，上述仪器是不能做出快速鉴定的，紫外分光光度法则显现出快速、简便、准确的优点。作者参考有关HPLC和紫外分光光度法文献[7-10]，根据自己实验室中毒标本较多的情况，建立了适用于氨茶碱中毒快速检测的双波长紫外分光光度法，对样本的萃取进行了改良，减少反提液0.1mol/L氢氧化钠溶液的量，提高方法的检出率和准确度，增加离心速度(8000r/min)，提高了氢氧化钠扫描液的清晰度，使测定减少了许多干扰因素。本方法测定氨茶碱血清药物浓度的方法回收率为83.8%～102.8%，犚犛犇为3.1%～4.9%。日内、日间犚犛犇分别为3.08%～5.00%和3.16%～4.95%，最低检出浓度2.0μg/mL。本方法操作简便、分析快速、结果准确，比较适用于基层医院开展氨茶碱血药浓度监测，实行个体化用药[11-12]，避免或减少茶碱中毒的危险;另外通过氨茶碱测定方法的实际应用表明：该方法操作时间不多于20min，非常适用于对疑似氨茶碱中毒的快速诊断和疗效观察。

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　　(收稿日期：2013-12-28)