RNA干扰沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响

作者                      作者单位

孙海波  辽宁医学院附属第一医院消化科,辽宁 锦州 121000

李 静   辽宁医学院附属第一医院消化科,辽宁 锦州 121000

安鼎伟  辽宁医学院附属第一医院消化科,辽宁 锦州 121000

陈 丽   辽宁医学院附属第一医院消化科,辽宁 锦州 121000

张照果  辽宁医学院附属第一医院消化科,辽宁 锦州 121000

大肠癌发生发展过程受诸多因素的影响〔1〕。传统的放疗、化疗及手术治疗仍不能获得理想的效果，而基因治疗逐渐成为大肠癌研究的热点。转录信号传导子与激活子家族(signal transducers and activators of transcription，STAT)的重要成员STAT3，其信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化，目前将其定义为癌基因〔2〕。本文通过RNA干扰(RNAi)技术抑制STAT3基因在人大肠癌细胞HCT116中的表达，观察其对大肠癌细胞生物学行为的影响，为大肠癌基因治疗提供有效靶点及技术。

1 材料与方法

1.1 材料 AntipSTAT3(Y705)、βactin兔抗人多克隆抗体购自cst公司。人结肠癌HCT116细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。转染试剂siPORT NeoFX购于Ambion公司，IMDM、胎牛血清购自Gibco公司，常规试剂由辽宁医学院科学实验中心提供。pSilencer1.0U6STAT3siRNAGFP重组质粒由本室保存，超纯质粒小样快速提取试剂盒(去内毒素)购于EZNA公司，质粒提取按说明书进行，经λDNA定量0.5 g/L者待用。

1.2 方法

1.2.1 MTT法 取对数生长期细胞，转染前1 h，0.25%胰酶消化后，含10%胎牛血清的IMEM培养基终止消化，收集备用。实验分为空白组(M)，pSH1SiScramble组(N)，pSH1SiSTAT3组(T)，T组再按质粒浓度分为T1、T2、T3。每组分24 h、48 h、72 h三个时间段，每时间段 4复孔。各组质粒分别取：N组0.8 μg，T1组0.6 μg，T2组0.8 μg，T3组1.2 μg加染试剂2.0 μl，于24 h、48 h、72 h相差显微镜下观察拍照后，各孔加入5 g/L的MTT 20 μl，孵育4 h，弃上清，每孔加入分析纯DMSO 100 μl，震荡10 min，酶标仪检测各孔吸光度值(A570)，计算细胞生长抑制率。实验共重复3次。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组/对照组)×100%。

1.2.2 细胞转染 转染前1 h，按上述方法收集细胞备用。实验分为M、N、T共3组。将转染试剂5.0 μl溶于终体积IMDM(17.7 g/L)100 μl，混匀后制成A液，室温孵化10 min;各组质粒分别取3.0 μg溶于IMDM(17.7 g/L)100 μl，混匀后制成B液;将A液加入B液，混匀后制成C液，室温孵化10 min。分配C液200 μl到6孔板各孔中，调细胞浓度为2×105/孔。转染后72 h，相差显微镜观察细胞生长情况后进行后续实验。

1.2.3 RT-PCR 收获的细胞按说明书完成RNA提取，取总RNA 10 μg逆转录为cDNA，PCR条件:94℃，5 min;94℃，30 s;56℃，30 s;72℃，45 s;72℃，7 min，30循环，25 μl体系，以βactin为内参。PCR产物以20 g/L琼脂糖凝胶电泳，Gene genius凝胶成像系统分析后，以STAT3/βactin产物量的比值为最终结果。实验重复3次。引物序列:STAT3：正向5′TTGCCAGTTGTGGTGATC3′，反向5′AGACCCAGAAGGAGAAGC3′;βactin:正向5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG3′，反向5′ATGCTATCACCTCCCCTGTG3′。

1.2.4 Western印迹法 收获的细胞，加入裂解液，超声裂解20 s，冰上静置30 min，12 000 r/min 4℃离心25 min，上清为总蛋白粗提液。BCA法蛋白定量，取总蛋白40 μg/20 μl，煮沸变性5 min，SDSPAGE电泳后半干法转膜至PVDF膜，AntiPSTAT3及βactin兔抗人多克隆抗体浓度为1∶1 000，碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗浓度为1∶1 000，NBT/BCIP 显色。Gene genius凝胶成像系统分析后，以STAT3/βactin蛋白量的比值为最终结果。实验共重复3次。

1.2.5 细胞免疫组化法 按上述转染步骤将细胞分M、N、T共3组转染于6孔板内，72 h后取出盖玻片，荧光显微镜下观察拍照后用40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗3次，蒸馏水洗3次，TritonX 100(0.3%)洗10 min，PBS洗5 min×3次，其余步骤按免疫组织化学染色说明书操作。阳性结果为细胞质或胞核棕黄着色，随机选取5个高倍镜视野，计数阳性细胞占所研究细胞的15%以上即为阳性。

1.2.6 流式细胞术(FCM) 取转染48 h后的细胞1×106个，离心后用冷PBS悬浮，1 000 r/min离心10 min，清洗2遍，弃上清，将细胞用1 ml注射器快速推入700 ml/L冷乙醇中，4℃固定12 h以上。PBS洗2次，调细胞密度为1×109/L，RNase消化后，加入50 mg/L 1.5 ml PI染液。混匀后上流式细胞仪做单参数分析，计算各期细胞所占比例，实验共重复3次。

1.2.7 AO/EB双染色 取转染72 h后的细胞，制成悬液并调细胞密度为1×1010/L，取20 μl加100 mg AO染液2 μl及100 mg EB染液2 μl，滴于载玻片，盖片封片后荧光显微镜直接观察，于20 min内计数500个细胞。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件行相关数据分析，计量资料采用x±s表示;两组均数的比较用t检验。

2 结 果

2.1 细胞增殖活性判定 参照转染试剂说明书推荐的质粒最佳转染浓度，设计3种不同浓度(0.015 g/L、0.020 g/L、0.030 g/L)的pSH1SiSTAT3，结果显示细胞增殖活性随质粒浓度增高而下降，但在0.020 g/L和0.030 g/L浓度之间变化不大，故选择0.020 g/L作为最佳质粒浓度进行以后的实验。MTT结果显示，N组细胞生长速度略慢于M组，T组细胞生长明显慢于M组及N组，生长抑制率24、48、72 h分别为13.32%、35.44%、 44.14%，48 h及72 h组与M组细胞相比均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 HCT116细胞STAT3表达 RTPCR结果显示，T组STAT3基因的mRNA表达明显降低，STAT3产物量/βactin的比值分别为0.866±0.03、0.853±0.02、0.453±0.03，T组与M组、N组相比均有统计学意义(P<0.05)，见图1。Western印迹结果显示，重组质粒治疗组PSTAT3蛋白表达亦明显减弱，STAT3蛋白量/βactin分别为0.780±0.01、0.713±0.01、0.430±0.01，有统计学意义(P<0.05)，见图2。细胞免疫组化结果显示，M组及N组胞浆和/或胞核中可见大量棕黄着色细胞，而T组仅见部分细胞核中含有棕黄色颗粒。表1 不同处理组HCT116细胞吸光度A值比较图1 不同处理组HCT116细胞STAT3基因mRNA表达

2.3 大肠癌HCT116细胞凋亡 FCM结果示T组细胞出现明显的细胞凋亡峰，凋亡率达20.6%，与M组及N组相比有统计学意义(P<0.05)。细胞周期分析示T组细胞出现G2期阻滞，T组S期与G2期细胞数与M组及N组相比有统计学意义(P<0.05)，见表2。AO/EB双染色结果M组及N组细胞呈绿色或黄绿色荧光，T组细胞可见较多黄色荧光，偶见红色荧光，提示实验组细胞较多呈早中期凋亡。见图3。图2 不同处理组HCT116 STAT3蛋白Western印迹表2 不同处理组HCT116细胞凋亡率及细胞周期分布图3 不同处理组HCT116细胞AO/EB双染色(荧光显微镜，×400)

3 讨 论

STAT3是作为白细胞介素6(IL6)信号传递中的急性反应因子最早被发现并被纯化的〔3〕，其所参与的JAK/STAT信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化，为肿瘤形成过程中的重要环节〔2，4，5〕。Joshua等〔6〕研究表明，STATs所介导的JAK/STAT信号转导通路在大肠癌的发生、发展中起重要作用。我们的前期研究亦证实在42例人大肠癌组织及癌旁组织中均有STAT3mRNA及蛋白的高表达，同时检测的下游基因cmyc、survivin及VEGF基因在大肠癌及癌旁组织中的表达亦增高，p53基因降低，提示STAT3的异常激活在大肠癌的发生和发展过程中起重要的促进作用并阻断了某些重要抑癌基因的活性〔7〕，因而STAT3基因可望成为大肠癌治疗的新靶点。

RNAi是近年发现的一种重要的转录后水平的基因沉默方式〔8〕。并以其高效性、高特异性等优点而作为研究基因功能的一种重要和常用的技术，已广泛用于基因研究和临床疾病尤其是肿瘤的治疗研究，有广阔的前景和应用潜力。Zheng等用RNAi技术在人胰腺癌SW1990细胞中成功的抑制了STAT3的表达，为防止胰腺癌的侵袭和转移提供了新的策略〔9〕。本研究应用针对人的STAT3基因的siRNA构建表达载体pSilencer3.0U6STAT3siRNAGFP，转染过度表达STAT3基因的人大肠癌细胞株HCT116，结果表明重组质粒在mRNA及蛋白水平均可抑制STAT3基因表达，MTT结果亦表明T组HCT116细胞的增殖活性明显减低，可见RNAi可使大肠癌HCT116细胞的生物学行为明显受抑，为大肠癌的基因治疗提供了可靠的依据。此外，应用RNAi沉默STAT3基因后，S期细胞所占比例明显减少而阻滞于G2期的细胞增加，凋亡细胞所占百分率明显增加，这与Kunigal等〔5〕在乳腺癌中的研究相似。表明RNAi抑制STAT3基因可促进HCT116细胞凋亡，有助于抑制大肠癌的侵袭和转移并指导诊疗。我们在本研究中还发现N组的细胞在转染后出现部分细胞形态改变， mRNA及蛋白表达也有变化，虽然与M组相比无显著性差异，但提示转染试剂及携有无关序列的表达载体对细胞还是存在一定的毒性作用及脱靶效应，如能有效克服，将使以siRNA为主的基因重组药物发挥更理想的治疗作用。

因此，应用RNAi技术可抑制STAT3基因在大肠癌细胞中的表达，人工合成的STAT3siRNAGFP可通过抑制大肠癌细胞的增殖、促进大肠癌细胞的凋亡而发挥抗肿瘤作用，STAT3基因可成为大肠癌治疗中重要的靶点。

【参考文献】

1 Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2008;(58):7196.

2 Kong LY,Wei J,Amit KS,et al.A novel phosphorylated STAT3 inhibitor enhances T cell cytotoxicity against melanoma through inhibition of regulatory T cells〔J〕.Cancer Immunol Immunother,2009;58(7):102332.

3 Lutticken C，Wegenka UM.Association of transcription factor APRF and protein kinase Jak1 with the interleukin6 signal transducer gp130〔J〕. Science,1994;263(5143):8992.

4 Samavati L,Rastogi R,Du W,et al.STAT3 tyrosine phosphorylation is critical for interleukin 1 beta and interleukin6 production in response to lipopolysaccharide and live bacteria〔J〕.Mol Immun,2009;146(89):186777.

5 Kunigal S，Lakka SS,Sodadasu PK,et al.Stat3siRNA induces Fasmediated apoptosis in vitro and in vivo in breast cancer〔J〕.Intern J Oncol,2009;134(5):120920.

6 Joshua MU,David W.Threadgill.Murine models of colorectal cancer〔J〕. Mamm Genome，2009;20(5):2618.

7 Chen L，Li J,Sun HB,et al.Screnning and analysis of STAT3 gene and growth control related genes in human colorectal carcinoma tissue〔J〕. Chin J Geron,2009;29(6):7035.

8 Kally ZP,Julia EP,Aric NR,et al.Inhibition of mRNA translation extends lifespan in Caenorhabditis elegans〔J〕.Aging Cell,2007;6(1):1119.

9 Qiu Z,Huang C,Sun J,et al.RNA interferencemediated signal ransducers and activators of transcription 3 gene silencing inhibits invasion and metastasis of human pancreatic cancer cells〔J〕.Cancer Sci,2007;98(7):1099106.