α-细辛醚对癫痫大鼠的海马钙稳态调控的影响

钙稳态是维持神经元正常功能的基础[l]。钙调蛋白(CaM)和钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)系统对调节神经元兴奋性起着重要作用。CaMKⅡ作为Ca2+信号系统中的一环,参与了癫痫发生、发展及癫痫发作后神经可塑性变化的全过程[2]。研究证实[3-4],α-细辛醚对癫痫大鼠有作用。为此,本实验研究了α-细辛醚对癫痫大鼠的海马钙稳态的影响。

材料与方法

1  材料

药品与试剂  α-细辛醚,纯度>99.5%,爱生药业(沈阳)有限公司生产;Lithium、Pilocarpine、Fura2/AM,购自Sigma公司。

仪器  F-45OO荧光分光光度计,日本Hitachi公司产品;Coulter流式细胞仪,美国Beckman Coulter公司产品。

动物  雄性Wistar大鼠,体重200-250g,购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所。

2  分组及给药

大鼠随机分为正常组、模型组、α-细辛醚组。每组又分为癫痫持续状态后12,24,48,72,168h等5个亚组。给予匹罗卡品前60min,α-细辛醚组给予a-细辛醚100mg·kg-1;正常组与模型组给予同等剂量的生理盐水。

3  建立大鼠Lithium-Pilocarpine癫痫模型

参照Dube等[5]方法并加以改进。腹腔注射匹罗卡品后,大鼠出现强直-阵挛持续状态,即癫痫持续状态(SE)。

4  海马神经细胞内游离Ca2+浓度[6]、游离钙调蛋白(CaM)相对活性[7]的测定

取双侧脑组织,冰盘上分离海马,剪成1mm3大小碎块。用0.1%胰蛋白酶消化20min,加人含10%小牛血清的RPMI1640培养基终止消化,制备细胞悬液,Fura-2/AM负载,荧光测定Ca2++浓度。

海马组织分离及细胞悬液制备方法同上,加入0.1mmol·L1三氟拉嗪2mL,悬浮,倒人培养皿中,250-260nm紫外光照射20min,离心,收集细胞,悬浮于不含钙的0.01mol·L-1PBS0.5mL中,流式细胞仪检测。

5 CaM免疫组织化学检测[8]

做冠状冰冻切片,厚度为8-10um,按照试剂盒操作步骤说明进行检测。以PBS取代一抗作为阴性对照。

结果判断:细胞浆和(或)细胞核呈棕黄色,为CaM阳性反应。以Tiger920图像分析系统,检测切片阳性平均光密度(AOD),以反映阳性反应信号强弱。每只大鼠取切片5张,在统一放大倍数(×100)及同一光强度下,分析额叶、海马CA1区、CA3区和齿状回(DG)的阳性平均光密度。

6 CaMKⅡa-mRNA原位杂交检测[9]

分离脑组织,液氮过夜,次日做冠状冰冻切片,厚度8-10um。按照原位杂交试剂盒操作步骤进行检测。以PBS取代探针,作为阴性对照。结果判断及图像分析同前。

7  统计学分析

数据以mean±SD表示,用SPSS10.0统计软件进行多因素方差分析,均数间两两比较用t检验,P<0.O5为差异有统计学意义。

结果

1  α-细辛醚对癫痫大鼠的海马神经细胞内游离Ca2+浓度、游离CaM平均通道荧光值的影响

各时点,α-细辛醚组海马神经细胞内游离Ca2+浓度均明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05),SE后1周,接近正常水平;表明αˉ细辛醚在SE后有降低海马神经细胞内游离Ca2+浓度的作用,见表1。

各时点,海马神经细胞内游离CaM平均通道荧光值,α-细辛醚组均明显高于模型组(P<0.O5);SE后1周,接近正常水平。表明α-细辛醚有增加SE后海马神经细胞内游离CaM平均通道荧光值的作用,见表2。

2  α-细辛醚治疗对癫痫大鼠的海马总CaM、CaMKⅡa-mRNA表达的影晌

各时点,大鼠海马总CaM表达,α-细辛醚组明显降低,至SE后1周,总CaM表达恢复正常水平;CaMKⅡa-mRNA的表达显著增强,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.O5)。

本研究结果表明,SE后,模型组大鼠海马游离Ca2+浓度均明显增高(P<0.O5),海马游离CaM平均通道荧光值明显降低,总CaM表达明显增强,提示海马内与Ca2+结合的CaM明显增多,海马CaMK IIa-mRNA表达显著降低(P<0.O5)。α-细辛醚能明显降低癫痫大鼠海马游离Ca2+浓度(P<0.05),增加海马游离CaM平均通道荧光值,降低海马总CaM表达,增强CaMK IIa-mRNA表达,与模型组相比,差异有统计学意义。SE所导致的Ca2+-CaM-CaMICIh调控异常及钙稳态失衡,可能是癫痫产生、发展的关键因素之一。α-细辛醚可能通过降低海马游离Ca2+浓度及结合CaM表达并上调CaMICIIa-mRNA表达,以减轻SE后海马Ca2+超载所导致的神经细胞损伤。

参考文献

[1]West AE,Chen WG,Dalva MB. Calcium regulation of neuronal gene expression[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),2001.11024-11031.

[2]DeLorenzo RJ,Sun DA,Deshpande LS. Cellular mechanisms underlying acquired epilepsy:the calcium hypothesis of the induction and maintainance of epilepsy[J].Pharmacology and Therapeutics,2005.229-266.

[3]苗静琨,陈启雄,吴小玫. 石菖蒲α-细辛醚抗癫痫模型疗效的研究[J].中国药理学通报,2008.1660-1662.

[4]苗静琨,陈启雄,吴小玫. 石菖蒲α-细辛醚对Lithium-Pi-locarpine癫痫模型GABA系统的调控作用[J].中国药理学通报,2011.1067-1071.

[5]Dube C,Marescaux C,Nehlig A. A metabolic and neuropathological approach to the understanding of plastic changes that occur in the immature and adult rat brain during Lithium-Pilocarpine-induced epileptogenesis[J].Epilepsia,2000,(Suppl.6):S36-S43.

[6]Sun DA,Sombati S,Blair RE. Calcium-dependent epileptogenesis in an in vitro model of stroke-induced" epilepsy"[J].Epilepsia,2002.1296-1305.

[7]Sun DA,Sombati S,Blair RE. Long-lasting alterations in neuronal calcium homeostasis in an in vitro model of stroke-induced epilepsy[J].Cell Calcium(Edinburgh),2004.155-163.

[8]DeLorenzo RJ. Calmodulin systems in neuronal excitability:a molecular approach to epilepsy[J].Annals of Neurology,1984,(Suppl):S104-S114.

[9]Chum SB,Kochan LD,DeLorenzo RJ. Chronic inhibition of Ca2+/calmodulin kinase Ⅱ activity in the pilocarpine model of epilepsy[J].Brain Research,2000.66-77.