芦丁在正常及糖尿病肾病大鼠体内药代动力学研究

作者                       作者单位

刘晓              徐州医学院药学院，江苏 徐州 221004

汤道权            徐州医学院药学院，江苏 徐州 221004

印晓星            徐州医学院药学院，江苏 徐州 221004

高媛媛            徐州医学院药学院，江苏 徐州 221004

魏雅芹            徐州医学院药学院，江苏 徐州 221004

陈永刚            徐州医学院药学院，江苏 徐州 221004

芦丁又名芸香苷、紫槲皮苷,为一来源很广的黄酮类化合物。主要存在于豆科植物槐(Sophora japonica L.)的花蕾(槐米)、果实(槐角)，芸香科植物芸香(Rutagraveolenslens L.)全草，金丝桃科植物红旱莲(Hypericum ascy ron L.)全草及蓼科植物荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)的籽苗、许多食品及植物饮料中。芦丁具有抗惊厥、抗氧化、细胞保护、抗血小板、抗凝血及血管保护作用[1-3]。此外, 芦丁尚有神经保护及改善心脏、脑及骨骼肌的化学损伤的作用[4-6]。芦丁同时还可以用于糖尿病[5-7]、肠炎[8]及糖尿病肾病的防治[7]。糖尿病肾病状态下，动物发生了许多生理及病理上的变化，药物的药代动力学行为也必将发生变化。尽管芦丁的药代动力学行为已见报道，但其在糖尿病肾病大鼠体内的药代动力学研究尚属空白[8-11]。因此本实验利用高效液相色谱结合二极管阵列检测器对芦丁在糖尿病肾病及正常状态下大鼠体内的药代动力学进行研究，初步探寻其防治糖尿病肾病的作用机制，为临床应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 动物

SD大鼠，SPF级，体重(220±10)g，雌雄各半，由徐州医学院实验动物中心提供(SYXK(苏)2001-0050)。

1.2 试剂与药品

芦丁(100080-200306)购自中国药品生物制品检定所;链尿霉素(streptozotocin，STZ, 批号P7993b，Plymouth Meeting, PA, USA);血糖检测药盒(批号2005110008，浙江东瓯生物工程有限公司);甲醇(色谱纯，美国Fisher Scientific 公司);水为双蒸水，其余试剂为分析纯。

1.3 仪器

Shimadzu LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津制作所)，包括SCL-10Avp 系统控制器、SPD-M20A 二极管阵列检测器、LC-10ADvp两元泵、SIL-20A自动进样器、FCV-10Alvp四元低压梯度洗脱系统、DGU-20As在线脱气机、岛津Lcsolution 色谱数据工作站。梅特勒托利多AE240电子天平(10-5，瑞士Mettler Toledo)，台式高速冷冻离心机(5417R，德国Eppendorf公司)。

1.4 供试样品及对照品溶液的制备

1.4.1 芦丁注射液

精密称取芦丁对照品适量置50 ml容量瓶中，用30%PEG 400生理盐水溶液溶解并稀释至刻度，配成5 g/L的芦丁溶液，0.22 μm 滤膜过滤，灌封，煮沸灭菌，备用。

1.4.2 对照品溶液

精密称取芦丁对照品5.05 mg置25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成202 g/L的芦丁对照品溶液。

1.5 动物实验方案及血浆样品处理方法

1.5.1 动物实验方案

健康雄性SD大鼠40只，体重(220±10)g。随机取8只作为正常组，其余32只大鼠禁食24 h后，腹腔一次性注射STZ 65 mg/kg(临用前溶于0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液，pH 4.4)，正常组仅给等量的该缓冲液。72 h后尾静脉取血，测定空腹血糖≥13.88 mmol/L者为造模成功(22只)。将糖尿病模型动物及正常动物饲养在SPF级实验室内，正常饮水及饮食，8周后将糖尿病模型动物分别放入金属代谢笼，准确收集24 h 尿液，测定体积及24 h尿蛋白。以出现蛋白尿为糖尿病肾病形成的标志(12只)。

随机取糖尿病肾病大鼠8只及正常组大鼠，分别静脉给予芦丁注射液(5 mg/kg)，给药前及给药后1、2、3、5、10、15、30、60、90、120、180、240 min眼底静脉层取血0.5 ml，根据实际情况适当补适量生理盐水。将全血置于肝素处理过的塑料离心管中，5 000 r/min离心15 min，分取血浆，-20°C冷冻保存，待测。

1.5.2 血浆样品处理方法

精密量取100 μl血浆，至1.5 ml塑料离心管中，精密加入1 ml甲醇，涡旋1 min，14 000 r/min离心15 min，分离上层有机相。40℃水浴上N2气流吹干，残渣加甲醇-0.1%甲酸(体积比80∶20)0.1 ml溶解，14 000 r/min 离心，转移上清，待分析。

1.6 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18(大连依利特有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：35℃，检测波长360 nm，进样量20 μl，流速1.0 ml/min。流动相A为甲醇，B为0.1%甲酸水溶液,线性梯度洗脱。洗脱程序： 0～10 min，40%～45%B;10～25 min，45%～55%B;25～26 min，55%～40%B;26～35 min，40%B。

1.7 数据处理

药代动力学参数的估算按中国药理学会推荐的药代动力学程序“DAS2.0”对血药浓度-时间数据进行自动拟合，根据AIC进行房室模型判别，参数AUC0-t、AUC0-∝、t1/2、MRT(0-t)、Cl、V等分别作方差分析及双侧t检验。

2 结 果

2.1 线性关系考察

取大鼠空白血浆0.1 ml，精密加入10个不同质量浓度的对照品溶液100 μl，按“1.5.2”项血浆样品处理方法进行处理，使其含芦丁浓度为：0.116 1、0.232 2、0.464 4、0.928 8、1.858、3.715、7.43、14.86、29.72、59.44 mg/L。在“1.6”项色谱条件下进样分析，记录峰面积。重复进样多次(n=5)。以峰面积(Y)对浓度(x)进行线性回归，建立回归方程。结果显示芦丁分别在0.116 1～3.715 mg/L及3.715～59.44 mg/L范围内峰面积与浓度之间线性关系良好，结果见表1。表1 大鼠血浆中芦丁标准工作曲线及检测灵敏度 (略)

2.2 灵敏度考察

取含芦丁浓度为0.1161 mg/L的质控样本，采用递减稀释的方法分别测定检测限和定量限。检测限及定量限分别以信噪比3∶1和10∶1为参考，结果见表1。由表中结果可以看出，本方法灵敏度较高。

2.3 专属性考察

实验条件下测得的空白血浆、空白血浆添加芦丁及大鼠静脉注射芦丁后血浆样品的典型色谱图如图1(A-C)所示。由图可见芦丁的保留时间为10.9 min，且在保留时间处无内源性物质的可见干扰。

2.4 回收率考察

按标准曲线测定方法配制芦丁高、中、低3个浓度水平的血浆样本各5份，按“1.5.2”项血浆样本处理方法进行处理，在“1.6”项色谱条件下进行分析，记录各组分色谱峰面积(As)。

另取对照标准贮备液适量，用甲醇-0.1%甲酸(体积比80∶20)配成与上述各组分高、中、低3个浓度水平一致的对照样品，在“1.6”项色谱条件下进行分析，记录各组分色谱峰面积(Ar)。

对上述As、Ar按As/Ar×100%计算，即得血浆样品处理方法的回收率 (Rec%)，结果(表2)表明，高、中、低3种浓度的平均回收率均>70%，相对标准偏差(RSD%)均小于10%，符合生物样本分析要求。

2.5 精密度考察

按标准曲线测定方法配制芦丁高、中、低3个浓度水平的血浆样本。按本章“1.5.2”项下血浆样品处理方法同样操作。在一个分析批内测定5次，计算批内精密度;在不同天连续制备并测定3个分析批，计算批间精密度。测定结果(表3)表明，血浆样品分析的精密度良好，RSD均<10%。

表2 大鼠血浆中芦丁HPLC/DAD含量测定提取方法回收率试验结果(略)

2.6 稳定性考察

血浆样本长期冷冻稳定性考察：配制各组分高、中、低3个不同浓度水平的血浆样本，置-20℃冰箱中保存，分别在0、1、2、3、7天室温解冻后，按既定样品处理步骤处理后，测定各组分浓度，计算血药浓度变异系数。结果(表4)表明，样品在冷冻7天内稳定，RSD均<10%。表3 大鼠血浆中芦丁HPLC/DAD含量测定精密度试验结果(略)表4 大鼠血浆中芦丁HPLC/DAD含量测定的稳定性试验结果(略)

待测样品冷藏放置稳定性考察：配制各组分高、中、低3个不同浓度水平的血浆样本，按既定样品处理步骤处理后，置4℃冰箱中保存，分别在0、24、48 h取出，进样分析，测定各组分浓度，计算血药浓度变异系数。结果(表4)表明，样品在4℃冰箱中48 h内稳定，RSD均<10%。

2.7 芦丁在正常及糖尿病肾病大鼠体内药代动力学研究 将芦丁注射液分别静脉注射给予正常及糖尿病肾病大鼠，按“1.5.1”项下采血方案进行试验，血浆样本处理方法按“1.5.2”项下进行，血药浓度按照“2.1”项下标准曲线进行计算。结果见表5，芦丁平均血药浓度对时间曲线见图2。

根据AIC进行房室模型判别，结果表明芦丁在正常及糖尿病肾病大鼠体内药代动力学行为均符合二房室模型，故采用“DAS2.0”软件按二房室模型进行拟合， 求得正常及糖尿病肾病大鼠静脉注射芦丁后的主要药代动力学参数，结果见表6(按矩量法求得)。表5 正常及糖尿病肾病大鼠静脉给予芦丁后血浆中的药物浓度(略)

由表6可见，分析时间内芦丁在糖尿病肾病大鼠体内AUC显著升高(P<0.05)，芦丁在糖尿病肾病大鼠平均滞留时间延长，代谢速度减慢，血浆清除减慢(MRT(0-t)、t1/2及Cl和正常组比较P均<0.05)，提示DN病理状态影响芦丁的药代动力学行为。表6 正常及糖尿病肾病大鼠静脉给予芦丁后药代动力学参数 (略)

3 讨 论

研究发现，芦丁在糖尿病肾病大鼠体内过程发生了显著的变化，其体内AUC(0-4)明显增加、体内平均滞留时间显著延长、血浆消除半衰期显著增大、血浆清除率显著减小，推测可能是糖尿病肾病状态下，大鼠肝药酶体系发生了改变导致芦丁代谢减慢，同时糖尿病肾病状态下，大鼠的肾功能遭到损伤，可能为芦丁排泄速度减慢的原因之一。本实验建立的高效液相色谱法，方法简便，专一性好，适用于临床芦丁血药浓度的测定。

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