HPLC测定某片剂中淫羊藿苷的含量

某片剂处方由淫羊藿、续断、熟地黄和牡蛎等9味中药组成,淫羊藿为处方的君药,而淫羊藿苷为淫羊藿的主要有效成分[1]。该处方具有补肾活血,强筋壮骨的功效,用于骨质疏松的预防和治疗。该制剂能促进成骨细胞的衍化和增殖,抑制破骨细胞的吸收,改善骨质疏松的症状,有明显抗炎止痛和增强免疫力等作用。据报道,淫羊藿苷作用于心血管系统,可抑制心肌收缩力,降低心肌耗氧量;淫羊藿苷作用于肿瘤细胞,在体外能诱导多种肿瘤细胞株的增殖=6Ⅱ淫羊藿苷还对生殖系统和内分泌系统有作用[7.9]。本文研究了高效液相色谱法测定淫羊藿芾,建立了适用于该片剂的质量检测方法,用于对该片剂的生产过程和最终产品质量进行监测。

1仪器与试药

Agilent1100液相色谱仪包括紫外检测器(美国惠普)。淫羊藿芾对照品(中国药品生物制品检定所,批号:1O47201601);乙腈(色谱纯,Fisher Chellca1s);重蒸馏水(自制);其余试剂为分析纯;(自制)。

2方法与结果

2.1色谱条件

2.1.1分析柱的选择选择shim packCLCDs(4.6mm×15omm,5um)色谱柱,以乙腈-水(24:76)为流动相,二者均达到满意的效果,淫羊藿苷峰与相邻峰分离度)2,理论塔板数以淫羊藿苷峰计算≥>4000。

2.1.2流动相的选择选用乙腈一水(24:7⑴为流动相,流速1mL/min,柱温25℃。实验研究表明淫羊藿苷峰与相邻峰分离度>2,阴性对照品溶液无干扰。

2.1,3检测波长的选择根据《中华人民共和国药典》2010版(一部)L1叫,选择270nm为淫羊藿药材中淫羊藿苷的检测波长。

2.2溶液的配制

2.2,1对照品溶液的配制精确称取60℃减压干燥4h的淫羊藿苷对照品10.27mg,加甲醇溶解并于容量瓶中定容至10mL,作为贮备液。取1mL贮备液用甲醇准确稀释并于容量瓶定容至10mL,作为对照品溶液。

2.2,2供试品溶液配制

2.2.2.l提取溶剂考察:实验以甲醇、30%乙醇、70%乙醇作为提取溶剂进行了考察。取样品10片(批号120106),研细,精确称取0,5g样品3份,分别置具塞三角瓶中,精确加入甲醇、70%乙醇和30%乙醇各50mL,密塞,精确称定质量,超声处理奎0min(功率350w,频率35kHz),冷却,再精确称定质董,用相应溶剂补足减失的质量,摇匀,过滤,滤液作为供试品溶液。按实验色谱条件测定,计算淫羊藿苷的含量,结果见表1。由表1可见,70%乙醇作为提取溶剂测得的样品含量明显高于以甲醇作为提取溶剂测得的样品含量,略高于30%乙醇作为提取溶剂测得的样品含量。因此,选择70%乙醇作为实验的提取溶剂。

2.2.2.2提取方法考察:实验对超声提取、回流提取进行了对比。取批号120106样品10片,研细,精确称取0.5g·共4份,两份置具塞=角瓶中,精确加人70%乙醇50mL,密塞,精确称定质量;超声处理40min(功率350w,频率35kHz),冷却后再精确称定质量,用70%的乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,过滤溶液即为供试品溶液(用于超声处理提取)。另2份置圆底烧瓶中,精确加入70%乙醇5O mL,密塞,精确称定质量,置水浴中加热回流2h,冷却后再精确称定质量,用70%乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,过滤溶液即为供试品溶液(用于加热回流提取)。按实验色谱条件测定淫羊藿苷,计算淫羊藿芾含量,结果见表2。由表2可见,超声处理提取与加热回流提取对淫羊藿苷含量的影响不明显,但超声提取时间短,效率高,因此选择超声处理(功率350w,频率35 kHz)为本实验提取方法。

2.2.2.3提取时间考察:取批号120106样品10片,研细,取0,5g,精密称定,共3份,分别置具塞三角瓶中,精确加人70%乙醇50mL,密塞,精确称定质量,分别超声处理20、40、60min(功率350w,频率35kHz),冷却后再精确称定质量,用相应溶剂补足减失的质量,摇匀,滤过,过滤溶液即为供试品溶液。按实验色谱条件测定淫羊藿苷,计算淫羊藿苷含量,结果见表3。由表3可见,超声处理60min后淫羊藿苷含量无变化,故本实验提取时间为40min。综上所述,供试品的制备方法为:取质量差异下的本品研细,精确称取0.5g,置具塞三角瓶中,精确加人70%乙醇50mL,密塞,精确称定质量,超声处理40min(功率350w,频率35kHz),再精确称定质量,用70%的乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,过滤液作为供试品储各液。按实验色谱条件测定淫羊藿苷,计算淫羊藿苷含量。

2.2.3阴性对照品溶液的配制取缺淫羊藿的各种原料,按该片剂生产工艺制备淫羊藿阴性对照品。取淫羊藿阴性对照品适量,按供试品溶液制备方法制备。

2.3阴性对照实验对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液分别进样测定,结果显示本实验测定条件下基本无阴性干扰。

2.4线性关系考察精确称取经60℃减压干燥4h的淫羊藿苷对照品10.31mg,置10mL容量瓶中,加甲醇溶液并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液I;精确吸取对照品溶液I1mL,置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液Ⅱ;分别精密吸取对照品溶液15、10、15uL,对照品溶液Ⅱ5、10、15uL。按实验色谱条件分析,测定峰面积,计算结果见表4。以进样量为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,其回归方程及相关系数为:Y=19 008X+80.028'=0.9999(X为淫羊藿苷进样量,Y为峰面积)。由图1可见,淫羊藿苷进样量在0.514~15,468 ug范围内,进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.5精密度实验精确吸取对照品溶液(0.331mg/mL)及供试品溶液10uL,注人液相色谱仪,按实验色谱条件进行分析,连续测定5次,测定峰面积,结果见表5。由表5可见,对照品峰面积平均值为5866,02,RSD为0.68%,供试品峰面积平均值为3144,26,RSD为0.55%,表明精密度良好。

2.6重复性实验按供试品(批号120106)制备方法制备5份供试溶液,按实验色谱条件进行测定,结果见表6。含量平均值为1.68%,RsD为0.8%,重现性好。

2.7加样回收率实验取批号为120106的样品(淫羊藿苷含量为1,68%)粉末0.25g,精确称定,共6份,分别精确加入淫羊藿苷对照品4.28mg,按质量标准含量测定方法测定,按下述计算式计算回归率,结果见表7,平均回归率为99.674%,RSD为1.9%。回收率=实测淫羊藿苷含量一样品中淫羊藿苷含量×100%通过以上方法学考察,表明该淫羊藿苷的含量测定方法的精密度高、重复性好、方法稳定,回收率为99,674%,RSD为1.9%,说明该方法可行,可以用于淫羊藿苷及其制剂的含量测定。

2.8含量测定按上述方法测定制各的5批样品,样品淫羊藿苷含量测定结果见表8。法以及提取溶剂(甲醇,乙醇)与水的比例对样品中淫羊藿苷提取率的影响,结果表明70%乙醇超声提取40min的淫羊藿苷提取率最高。

3讨论

3.1条件的选择`笔者考察了不同提取时间、超声和回流提取方法以及提取溶剂(甲醇,乙醇)与水的比例对样品中淫羊藿苷提取率的影响,结果表明70%乙醇超声提取40min的淫羊藿苷提取率最高。

3.2专属性高用本法测定原料中淫羊藿苷含量时,所得结果与按药典中淫羊藿项下定量分析方法测定结果一致。但用本法可以排除在对产品和过程中间品的测定中其它成分的干扰。

3.3重复性好中药复方制剂的成分复杂,如何使主要成分与杂质分离尤为重要。笔者曾采用乙醇醇沉,挥干乙醇后再用甲醇溶解的方法进行样品前处理,结果所得溶液杂质较多。而采用甲醇醇沉、三氯甲烷果所得溶液杂质较多。而采用甲醇醇沉、三氯甲烷果所得溶液杂质较多。而采用甲醇醇沉、三氯甲烷性好,阴性无干扰,加样回收率较高。

3.4淫羊藿的提取部位淫羊藿苷的含量测定方法已有多篇文献报道,但是不同剂型和不同中药配伍对方法的专属性要求较高。试验时样品中淫羊藿苷的含量测定值差别较大,其原因可能是本制剂采用的中药淫羊藿购自不同产地,且2010年版药典将淫羊藿的药用部位由“地上部分冶”修订为“叶冶”。市场上淫羊藿的药用部位尚未统一,质量参差不齐,造成制剂中淫羊藿苷的含量差异较大。

3.5方法的准确性本法样品处理方法便捷,测定方法简单,测定结果准确可靠。结果表明本法可用于某片剂生产过程全程(从原料、中间品到产品)质量控制。

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