电化学免疫传感器检测样品中黄曲霉毒素B1的误差分析

　　黄曲霉毒素（AFT）是一类结构和性质相似的真菌次生代谢产物，具有强毒性、高稳定性、强致癌性，产AFT的细菌包括黄曲霉菌和寄生曲霉菌[1].常见的AFT主要有B1、B2、G1、G2、M1、M2等亚型，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）的存在量和毒性都是最大的[2].AFB1广泛存在于粮油食品中，尤其是在高温高湿地区的玉米、花生、大米、大豆的污染最为严重[2].研究表明，AFB1能够诱发肝癌、胃癌、肾癌或食道癌等严重疾病[3].电化学免疫传感器是将免疫技术和电化学检测技术相结合的一种新分析方法，利用信号转换器（电化学工作站）把分子识别器（探针）与被测对象发生的物理或化学变化转变成电信号[4].该技术具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点，因此应用电化学免疫传感器检测样品中AFB1具有非常重要的意义[5].电化学免疫传感器自建立以来，主要应用于重大疾病标志物的检测[6.7].近年来，该技术逐步被应用于食品中真菌毒素的检测，但相对文献较少，尤其针对食品中AFB1的电化学生物传感器检测技术的研究与应用尚不成熟[8.12].作者成功构建了AFB1的电化学免疫传感器检测体系，但在实际应用时发现，样品的前处理过程、反应抗体的量都对检测结果有明显影响，尤其是对某些成分复杂的样品进行检测时，会出现假阳性和假阴性结果。本研究针对电化学免疫传感器检测法在检测样品中AFB1时，遇到的实际问题展开研究，对抗体敷育时间、样品前处理等影响因素进行分析。　　1 材料与方法　　1.1材料AFB1.牛血清清蛋白偶联物（AFB1.BSA）、AFB1单克隆抗体、碱性磷酸酶标记二抗、AFB1标准溶液、1.乙基。3.碳二亚胺（EDC）、N.羟基琥珀酰亚胺（NHS）、α。萘基磷酸盐（α。NP）均购自Sigma.Aldrich公司，玉米粉阳性样品购自Trilogy分析实验室，AFB1免疫亲和柱购自北京华安麦科生物技术有限公司，羧基化单壁碳纳米管购自南京先丰纳米材料科技有限公司，甲醇、乙腈等其他试剂均购于重庆茂业化学试剂有限公司。　　1.2检测仪器CHI660D型电化学工作站为上海辰华仪器公司产品；三电极体系：工作电极为自制免疫电极，参比电极为银/氯化银（Ag/AgCl）电极，对电极为铂丝电极。　　1.3检测原理在玻碳电极表面通过化学法修饰铺上一层羧基化单壁碳纳米管（SWNTs），并利用3.二甲基氨基丙基亚胺（EDC）/NHS连接剂共价键合。AFB1.BSA通过蛋白质氨基端与羧基化单壁碳纳米管上的活化羧基反应连接，并通过抗原抗体反应与同时加入的AFT单体来竞争吸附一抗，再加入碱性磷酸酶标记的二抗，通过碱性磷酸酶与底物反应产生的电化学信号绘制标准曲线和得到实测样品AFT水平。　　1.4样品前处理方法　　（1）方法1:参照酶连免疫吸附试验（ELISA）样品前的处理方法。玉米样品经粉碎后取25g（过2mm分样筛）加入5g氯化钠与125mL60%的甲醇溶液混匀；200~300r/min剧烈振荡20min,用快速定性滤纸过滤；取滤液1mL,再加入4mL去离子水混匀，取50μL进行分析。　　（2）方法2:参照Trilogy试验样品前处理方法。玉米样品经粉碎后取5g（过2mm分样筛）加入1g氯化钠与25mL84%的乙腈溶液混匀；200~300r/min剧烈振荡20min,用快速定性滤纸过滤；取滤液1mL,再加入4mL去离子水混匀，取50μL进行分析。　　（3）方法3:在方法1的基础上，取10mL滤液并用20mL蒸馏水稀释，再用微纤维滤纸过滤；取15mL上AFB1亲和柱（此溶液的pH需调至6~8）；待液体排干后，用去离子水洗涤2次，每次10mL,流速2~3滴/秒；待液体排干后，上样1mL甲醇，用样品瓶接洗脱液，流速1滴/秒；取洗脱液1mL,再加入4mL去离子水混匀，取50μL进行分析。　　2 结果　　2.1电化学免疫传感器电极修饰结果由图1可以看出，曲线a为裸玻碳电极在Fe（CN）63-/Fe（CN）64-溶液中呈现的可逆氧化还原峰；当裸玻碳电极修饰单壁碳纳米管（曲线b）后，氧化还原电流明显增大，这是由于铺上SWNTs后促进电子的传递并增大了比表面积，溶液中的Fe（CN）63-/Fe（CN）64-更易在电极表面发生电荷转移；当电极修饰AFB1.BSA（曲线c）、AFB1抗体（曲线d）、AP标记二抗（曲线e）之后，氧化还原电位依次逐步减小，这是因为AFB1.BSA、AFB1抗体、AP标记二抗覆盖电极表面，膜厚度层层加大，溶液中的Fe（CN）63-/Fe（CN）64-离子在电极表面发生电荷转移的难度也随之加大，因此有效证明电极修饰成功。　　2.2AFB1抗体和二抗敷育时间对检测的影响随着AFB1抗体孵育时间的增加，信号响应值也不断增强，并且在90min达到最大。一抗孵育浓度一定时，经过37℃90min孵育后检测效果最好，见图2A（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。在最佳AFB1抗体浓度和孵育时间的基础上，继续在电极表面滴加二抗，孵育时间分别为30、60、90、120、150min测量值比较，结果表明二抗的最佳孵育时间为90min,见图2B（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。　　2.3不同前处理方法对电化学免疫传感器测定结果的影响样品中干扰物质的存在，是影响电化学免疫传感检测灵敏性和特异性的重要因素。由图3可以看出，采用方法1和方法2,即用60%甲醇和60%乙腈萃取粗提，样品信号峰与干扰物杂峰重叠，严重影响测定结果；采用方法3,即用60%甲醇萃取粗提后，再用AFB1免疫亲和柱纯化浓缩能够完全排除样品基质和提取溶剂的影响。　　a:裸玻碳电极在Fe（CN）63-/Fe（CN）64-溶液中呈现的氧化还原峰；b:裸玻碳电极修饰单壁碳纳米管后的氧化还原峰；c:电极修饰AFB1.BSA后的氧化还原峰；d:电极修饰AFB1抗体后的氧化还原峰；e:电极修饰AP标记二抗后氧化还原峰。　　3 讨论　　电化学免疫传感器具有快速、简便、检测限低等特点，在食品安全检测方面获得越来越多的应用[13.16].本研究结果优化了电化学免疫传感器检测方法，确定AFB1抗体和二抗的孵育时间为90min效果最好。进一步研究表明，由于样品基质中有干扰物存在，不同的前处理方法对样品检测结果有较大影响，其中利用60%甲醇萃取粗提后，再用AFB1免疫亲和柱纯化浓缩，检测结果最好，回收率最高。　　参考文献　　[1]MphandeFA,SiameBA,TaylorJE,etal.aflatoxinsandcyclopia.zonicacidassociatedwithpeanutretailinginBotswana[J].JFoodProt,2004,67（1）：96.102.　　[2]SiddiqueNA,MujeebM,AhmadS,etal.Determinationofaflatox.insinmedicinalplantsbyhigh.performanceliquidchromatography[J].JPharmPharmSci,2013,16（2）：321.330.　　[3]RicciF,VolpeG,MicheliL,etal.Areviewonnoveldevelopmentsandapplicationsofimmunosensorsinfoodanalysis[J].Analyticachimicaacta,2007,605（2）：111.129.　　[4]GrieshaberD,MacKenzieR,VrsJ,etal.Electrochemicalbio.sensors.Sensorprinciplesandarchitectures[J].Sensors,2008,8（3）：1400.1458.　　[5]LavecchiaT,TibuzziA,GiardiMT,etal.Biosensorsorfunctionalfoodsafetyandanalysis[J].AdvExpMedBiol,2010,698（2）：267.281.　　[6]CentiS,LaschiS,MasciniM.Strategiesforelectrochemicaldetec.tioninimmunochemistry[J].Bioanalysis,2009,1（7）：1271.1291.　　[7]KongW,WeiR,LogriecoAF,etal.OccurrenceoftoxigenicfungianddeterminationofmycotoxinsbyHPLC.FLDinfunctionalfoodsandspicesinChinamarkets[J].FoodChem,2014,146（3）：320.326.　　[8]ZhangZ,LiY,LiP,etal.Monoclonalantibody.quantumdotsCdTeconjugate.basedfluoroimmunoassayforthedeterminationofaflatoxinB1inpeanuts[J].FoodChem,2014,146（3）：314.319.　　[9]赵晓联，赵春城，纽伟民。酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1误差分析[J].中国卫生检验杂志，2001,11（4）：473.474.　　[10]孙秀兰，张银志，汤坚。金标免疫层析试条检测样品中黄曲霉毒素B1的误差分析[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2007,35（7）：188.192.　　[11]鲍蕾，刘心同，张艺兵。多功能柱净化高效液相色谱法检测花生中的黄曲霉毒素[J].检验检疫科学杂志，2005,15（5）：23.25.　　[12]谢刚，王松雪，张艳。超高效液相色谱法快速检测粮食中黄曲霉毒素的含量[J].分析化学杂志，2013,41（2）：223.228.　　[13]霍群，蔡豪斌。电化学免疫传感器[J].临床检验杂志，2003,21（3）：181.182.　　[14]朱祯敏。电化学免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用[J].现代科学仪器，2011（5）：48.50.　　[15]陈钰，刘仲明，王捷。用于肿瘤标志物检测的电化学免疫传感器[J].生物磁学，2009（16）：3166.3168,3197.　　[16]许园园，吴雅欣，潘家荣。自组装膜电化学免疫传感器测定甲基对硫磷[J].核农学报，2009,23（3）：497.500.　　（收稿日期：2014.01.11）