中药安迪注射剂对白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响

作者                                    作者单位

李妍                       第四军医大学药 陕西,西安,710033王四旺                     第四军医大学药 陕西,西安,710033张海                       第四军医大学药 陕西,西安,710033

中药具有十分重要的抗肿瘤作用，中药诱导肿瘤细胞凋亡也已成为近年来国内外研究的热点. 王四旺等[1-2]研制的安迪 (andi injection，Adi) 注射剂中的主要成分蟾酥，具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用，其化学成分含有蟾毒灵(bufalin，BL)，是蟾酥中的活性成分. 田昕等[3]的研究表明, BL是一种有效的肿瘤细胞分化诱导剂，具有显著的抑制肿瘤生长的作用. 本研究通过实验观察Adi 对体外培养的人白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响，为寻找到新的更有效的抗肿瘤药提供依据.

1材料和方法

1.1材料

Adi(生产批号：20060901，由第四军医大学药物研究所提供)，实验前用生理盐水溶解，0.22 μm 滤膜过滤除菌后使其终浓度为1 mg/mL，4℃保存，测pH 值为7.2. 二甲基亚砜，四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma 公司);RPMI1640(GIBCO公司);小牛血清(杭州四季青生物工程公司);K562细胞株(第四军医大学实验动物中心提供).

1.2方法

1.2.1细胞培养

将K562细胞悬浮培养在RPMI1640培养液中(含10 ml/L 加热灭活胎牛血清，1 mmol/L谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸钠,青霉素、链霉素各10 ×105 U /L) ,培养条件为37℃，50 mL/L CO2饱和湿度，培养基为含10 ml/L小牛血清的RPMI1640，在37℃，50 mL/L CO2条件下培养，1～2 d传代1次，实验前24 h半量换液，用锥虫蓝拒染法鉴定细胞活性在0.98以上.

1.2.2MTT法检测

K562细胞的活力采用文献[4]的方法检测细胞活力，实验时调整细胞数为1×105/ mL，在培养板上接种处于对数生长期的K562细胞，每孔加细胞悬液200 μL. Adi各处理组每孔加入Adi，终浓度分别为2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0和160.0 μg/mL;对照组每孔加入等体积生理盐水，每组均设3个复孔. 将培养板放至37℃，50 mL/L CO2温箱培养36 h，加入MTT 20 μL溶液，继续培养4 h后，离心，弃上清， 加入二甲基亚砜150 μL，微型混合器振荡，使结晶完全溶解，酶联检测仪在波长490 nm处测定每孔的吸光度(A)值. 实验重复3次.

1.2.3检测细胞凋亡率

K562细胞经10.0，20.0 μg/mL Adi 处理并培养36 h，收集细胞(每组至少5×105个细胞)，参照文献[5]的方法采用Annexin VFITC及PI染色后上机操作，以未染色细胞将机器调零，以Annexin VFITC单染管和PI单染管作基准参照，选取散点图作直观显示.

1.2.4K562细胞的形态学观察

5.0 μg/mL Adi 处理组和对照组K562细胞培养36 h后, 1000 r/min离心10 min，收集细胞. 用无血清培养液洗涤后再次1000 r/min离心10 min，沉淀用2.5 mL/L戊二醛固定2 h，1 mL/L锇酸固定1.5 h，乙醇梯度脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，JEM2000EX透射电镜下观察.

统计学处理： 采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，数据以x±s表示，统计学推断采用单因素方差分析，多重比较采用LSDt检验, P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1MTT法检测

K562细胞活性随着Adi 浓度的增高和作用时间的延长, K562细胞的存活数下降，在作用24 h后细胞基本上存活，处理36 h后细胞多数凋亡，但48 h后不同剂量Adi处理组细胞基本都已死亡， 提示Adi 引起K562细胞凋亡最佳时间为36 h. 对照组的A值(0.629±0.016)与2.5 μg/mL Adi 处理组的A值(0.489±0.033)的差异具有统计学意义(P<0.05)，大于20.0 μg/mL Adi 处理组A值(0.175±0.022)与20.0 μg/mL Adi 处理组A值(0.208±0.033)的差异无统计学意义(P>0.05). 因此Adi引起K562细胞凋亡的最小浓度为2.5 μg/mL，最大浓度为20.0 μg/mL.

2.2细胞凋亡率

K562细胞给药36 h流式细胞仪分析结果表明，细胞呈现出明显亚二倍体凋亡峰，且细胞凋亡及凋亡后死亡数量随着给药量的增加而增加. K562细胞在对照组以及10.0 μg/mL和20.0 μg/mL不同浓度的Adi作用下，凋亡细胞所占比例分别为10%，50%和39%，死亡细胞所占比例分别为3%，44%和56%.

2.3细胞形态学观察

电镜下可见对照组K562细胞呈圆形或卵圆形，表面有少量微绒毛，细胞器丰富，可见少量脂滴，细胞核不规则，核膜皱折样凹陷，核内染色质丰富，以常染色质为主，核仁大而明显，核质比较大;而经Adi 处理后的K562细胞表面微绒毛消失，细胞膜光滑，细胞质浓缩成块状，核染色质边集沿核膜边缘排列(图1).

3讨论

BL是从传统中药蟾酥中提取的蟾毒配基之一，研究表明BL 对人红细胞膜Na+2K+2ATP 酶有强烈抑制作用和显著的抑制肿瘤生长作用,能够促进荷瘤动物细胞免疫功能,与化疗药物环磷酰胺/丝裂霉素C等起协同作用,能升高白细胞,有放射防护功能[6].

BL是一种有效的分化诱导剂, 用其处理三株来源于人的白血病细胞系，包括早幼粒白血病HL60细胞，成单核细胞白血病U937细胞和成髓细胞白血病ML1 细胞, 观察到诱导分化的效果, 三株细胞均朝单核/巨噬细胞样细胞的方向分化. 有研究显示, BL处理HL60 细胞以后,电镜下可见诱导分化的细胞将凋亡小体作为异己分子吞噬[7].

本结果显示，与对照组相比，Adi 各剂量处理组明显抑制K562细胞生长并促使其凋亡，而且存在一定的剂量效应关系，提示Adi 中药有效成分BL可以抑制白血病K562细胞增殖和促使其凋亡. 进一步的研究发现, Adi 能够体外诱导白血病细胞凋亡, 具有典型的细胞凋亡形态学变化. 在实验中我们还发现，在高剂量的Adi(20.0 μg/mL)作用下也可引起K562细胞凋亡性死亡. 由此可见, Adi 体外能抑制白血病 K562 细胞增殖, 具有一定的抗白血病的潜力和应用前景.

【参考文献】

[1]王四旺，梁军，孙纪元，等. 安迪粉针剂抗肿瘤作用的实验研究[J]. 西北药学杂志，2005,17(6):253-255.

[2]王四旺， 刘玉凤， 孙纪元， 等. 中药安迪粉针剂对小鼠巨噬细胞cAMP 含量的影响[J].第四军医大学学,2003,24(5):454-456.

[3]田昕，罗颖， 刘云鹏， 等. 蟾蜍灵诱导HL60细胞凋亡过程中对Bc12, Survivin, Smac/DIABL0 表达的影响[J]. 中华血液学杂志,2006,27(1):21-24.

[4]司徒镇强，吴军政.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司，2004:251.

[5]刘芳，陈燕， 崔国慧，等. 雷公藤内酯对红白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响[J].华中医科大学学报(医学版),2005,34(3):308-309.

[6]Oda M, Kurosawa M, Numazawa S, et al . Determination of bufalin like immunoreactivity in serum of humans and rats by timeresolved fluoroimmunoassay for using a monoclonal antibody[J].Life Sci, 2001, 68 (10):1107.

[7]徐瑞成，陈小义， 陈莉，等. 蟾蜍灵诱导白血病HL60 细胞分化及相关基因表达[J]. 中草药,2002,33(2):151-153.