内皮祖细胞与心血管疾病

　　　作者：Eduard Shantsila，et al

　　【关键词】 心血管

　　血管内皮在心血管生物学的重要作用日益受到重视。动脉粥样硬化、血栓形成和高血压均存在内皮损伤，内皮损伤和修复的平衡在减少心血管事件方面起到至关重要的作用。然而成熟内皮细胞的再生增殖能力有限。因此循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，特别是其在维持内皮完整性和内皮功能及出生后血管新生方面的作用，越来越受到关注。其他相关研究也为临床EPCs应用的可能性提供了依据。事实上很多证据表明在心血管疾病和相关致病危险因素存在时内皮祖细胞的可用性降低，功能受损。本文主要对内皮祖细胞的临床相关研究结果及其在心血管疾病的治疗前景作一综述。

　　1 生理因素与EPCs

　　有关研究数据证实年龄可能影响EPCs的可用性和功能。衰老与冠心病患者的循环EPCs数量减少相关。Scheubel等证实稳定型冠心病患者存在年龄依赖的循环EPCs的丢失。因此老年患者在冠状动脉旁路移植术后EPCs动员的数目明显减少。很多因素可能参与年龄相关的EPCs数量减少和功能退化。长期暴露于心血管危险因素可能影响EPCs动员、黏附和血管再生能力。EPCs功能障碍也可因EPCs加速老化、凋亡及骨髓中祖细胞池耗竭所致。血管生成和动员相关细胞因子的水平降低与年龄依赖的EPCs动员受损有关。血管内皮生长因子(VEGF)和一氧化氮(NO)在内皮细胞动员、移行、增殖和存活方面可能起协同作用，其生成因增龄而减少。人类端粒酶逆转录酶的变化也可影响EPCs再生能力。

　　体育锻炼可改善冠心病、慢性心力衰竭和外周动脉疾病患者的内皮功能、运动耐量及侧支循环。运动对EPCs的上调可能有赖于内皮NO和VEGF水平或EPCs凋亡减少。

　　2 心血管危险因素与EPCs

　　越来越多的证据显示，心血管危险因素可影响EPCs数量和特性。EPCs数量(和功能)与心血管危险因素在健康人群和冠心病患者中呈负相关。EPCs数量与内皮功能相关，与Framingham评分相比是更好的预测因子。

　　2.1 血脂

　　众多研究一致显示，血脂代谢影响人EPCs的生物活性。EPCs集落刺激单位的数量在健康个体随血清胆固醇水平升高而明显减少。在冠心病患者中LDLC水平与循环中EPCs的数量呈负相关。此外在高胆固醇血症患者中分离的EPCs，其增生、移行、黏附和体外生成血管能力功能均受损。EPCs经oxLDL培养可呈现剂量依赖性EPCs功能活性受损，并可能由于端粒酶失活加速EPCs老化，伴随高达70%的EPCs数量减少。此外oxLDL还可通过Akt失活损伤VEGF介导的EPCs分化。HDLC和TG可正向调节EPCs集落刺激单位的数量，但对于CD34+/CD33+祖细胞无此作用。

　　2.2 高血压

　　高血压是众多危险因素中使EPCs移行功能受损的最强预测因子。血管紧张素Ⅱ减少EPCs的端粒酶活性，增加氧化应激加速EPCs老化进程。对于血管紧张素Ⅱ对EPCs体外增殖的影响还存在争议。虽然有一项研究提示血管紧张素Ⅱ可抑制EPCs的增殖，但另一研究中其可增加VEGF介导的EPCs增殖。血管紧张素Ⅱ也可能通过上调激酶插入部位受体(KDR)增加VEGF介导的EPCs网络形成。

　　2.3 糖尿病

　　EPCs的数量在1型和2型糖尿病均减少。明显的EPCs功能障碍可能是糖尿病患者血管并发症的新的发病机制。实际上在上述情况下EPCs的增殖、黏附和血管成形能力均受损。Krnkel等进一步证明健康供者的外周血单个核细胞(MNCs)在高糖状态下培养，EPCs数量明显减少、NO产生受抑、基质金属蛋白酶9(MMP9)活性受抑，细胞移行和黏附能力受损。

　　2.4 其他危险因素

　　循环中EPCs数量与吸烟支数呈负相关。EPCs数目与戒烟增加相关，如果再次吸烟EPCs数目将迅速减少至戒烟前水平。同型半胱氨酸为另一常见的心血管危险因素，可使人外周血EPCs的数量减少，活性受损。内源性NO合成酶抑制剂非对称二甲基精氨酸(ADMA)也参与内皮细胞功能障碍和抑制血管形成，为未来主要不良心血管事件或死亡的独立生物标志物。

　　3 EPCs与心血管疾病

　　3.1 稳定型冠心病

　　虽然严重慢性冠心病患者与对照组相比循环中CD34+/CD45+和CD133+/CD34+祖细胞和EPCs数量类似，但是体外骨髓源性MNCs的功能明显受损。给下肢缺血的裸鼠移植冠心病患者的骨髓源性MNCs，结果显示其修复组织再灌注的能力明显受损。

　　3.2 不稳定型冠心病

　　已证实不稳定型心绞痛患者的EPCs集落刺激单位数目增加，黏附力无变化，临床情况稳定后EPCs数量可减少约50%。 体内C反应蛋白(CRP)水平与循环中EPCs的数量明显相关，与其黏附力无关，提示不稳定型心绞痛患者中身体的炎症影响EPCs动员。CRP可抑制EPCs增殖、存活、分化和功能，提示其在心血管疾病发展中可能起一定作用。

　　心肌梗死患者循环EPCs数量在发病初期明显增加，心肌梗死第7天达高峰。其后EPCs数量减少，心肌梗死第60天与对照组相比无差别。血浆VEGF水平与循环EPCs数量明显相关，其水平在心肌梗死第7天也达高峰。这些数据显示VEGF对急性冠状动脉综合征中EPCs的动员起重要作用。然而因为大多数心肌梗死患者均应用他汀类或血管紧张素转换酶抑制剂等EPCs动员药物治疗，故心肌梗死患者外周血EPCs升高的始动因素还不明确。

　　3.3 心力衰竭

　　急性心力衰竭患者的EPCs数量升高，与细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)水平显著相关。EPCs的数量差别与心力衰竭分级有关，心力衰竭早期NYHA心功能Ⅰ、Ⅱ级时，EPCs数量相对较多，心功能为Ⅲ、Ⅳ级时，EPCs数量进行性减少。

　　3.4 其他疾病

　　勃起功能障碍、支架内再狭窄和移植心脏伴血管病变的患者也存在EPCs数量的减少。EPCs的数量似乎和脑血管粥样硬化的程度不相关，但脑卒中后或经PET诊断为脑梗死的动脉粥样硬化患者(包括无临床脑卒中者)，其EPCs数量明显减少。

　　4 药物治疗对EPCs的影响

　　4.1 HMGCoA还原酶抑制剂(他汀类)

　　与其直接作用于内皮细胞的作用一致，对EPCs的激活可能为他汀类药物改善内皮功能的另一机制。他汀类药物可通过细胞周期调节基因刺激EPCs增殖。此外他汀类药物可通过PI3激酶/Akt途径诱导EPCs分化，通过增加连接素表达增强其黏附，上调EPCs端粒酶的应答结合因子2(TRF2)，增加其移行活性。实验证实他汀类药物影响EPCs的活性与其降胆固醇作用无关。

　　4.2 肾素血管紧张素醛固酮系统

　　肾素血管紧张素醛固酮系统与多种心血管疾病有关，可能参与EPCs功能障碍。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂奥美沙坦或伊贝沙坦可显著增加EPCs数量。也有报道缬沙坦可通过上调端粒酶的活性加速EPCs的老化。血管紧张素转换酶抑制剂雷米普利可增加冠心病患者的EPCs数量，改善其功能，而与其降压作用无关。

　　4.3 雌激素

　　雌激素对人类EPCs的作用无直接相关研究，但女性血雌激素水平与循环中EPCs数量相关。雌二醇可刺激颈动脉损伤动物模型的EPCs动员、增殖、促有丝分裂活性和移行，抑制EPCs凋亡。

　　4.4 其他药物

　　伐地那非(一种磷酸二酯酶的抑制剂)、葛根素和银杏叶提取物可增加EPCs活性。雷帕霉素可在体外抑制人EPCs增殖和分化。2型糖尿病患者应用罗格列酮不仅可增加所培养的EPCs数量和移行活性，而且可削弱CRP对EPCs的不利影响。还有报道促红细胞生成素水平与EPCs数量及功能活性均相关。使用促红细胞生成素可增加肾性贫血者和健康者的具有活性功能的EPCs的数量。

　　5 EPCs移植——临床经验

　　越来越多的证据证实，EPCs可在损伤部位聚集，参与受损部位的修复及缺血心肌、下肢和大脑的血管新生。许多临床预试验证实，EPCs在动物缺血性疾病和血管损伤模型中有治疗作用。一些小规模的一期临床试验证实，骨髓MNCs移植可治疗心肌梗死、下肢缺血、严重的稳定型冠心病和心力衰竭，为EPCs移植治疗的安全性和可行性提供了初步证据。

　　Stamm等报道，6例心肌梗死后10 d至3个月的患者在行冠状动脉旁路移植术时于梗死区域边界注射自体CD133+骨髓细胞，术后3～9个月随访，其中4例患者的整体左室功能、舒张期左室内径有所改善，5例患者梗死区域灌注改善，无不良反应。

　　TOPCAREAMI (Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction)研究中，20例急性心肌梗死患者随机冠状动脉内输注非体内扩增骨髓MNCs或源自外周血MNCs培养的EPCs。4个月后随访见左室射血分数和梗死区域的室壁运动明显增加，心脏形态、冠状动脉血流储备和损伤区域心肌活力改善，收缩末期直径减小。本试验最终1年随访结果证实治疗组左室功能持续改善，收缩末容量及心肌功能障碍区域缩小。

　　BOOST (Bone Marrow Transfer to Enhance STElevation Infarct Regeneration Trial)试验为随机对照研究，主要评价60例心肌梗死患者接受PCI治疗时输注骨髓细胞的治疗效果。结果显示在自体骨髓MNCs输注后6个月，患者的左室整体射血分数及梗死边界区域收缩期室壁运动增加。然而随访18个月后，两组在左室收缩力上差异无统计学意义，细胞治疗可能仅加速左室功能的恢复。

　　另一项随机、双盲、安慰剂对照研究中，67例急性心肌梗死患者在经皮冠状动脉再灌注治疗后冠状动脉内输注自体骨髓MNCs。虽然4个月随访时显示梗死面积缩小，但左室功能无显著改善。此研究为心肌梗死后24 h内输注细胞，远早于其他研究，提示干细胞移植时间的重要性。

　　以研究严重外周动脉疾病引起下肢缺血为目的的研究TACT研究(Therapeutic Angiogenesis Using Cell Transplantation)证实自体骨髓MNCs注射入腓肠肌后4周，细胞治疗组较安慰剂组(生理盐水)患者肢体踝臂指数显著改善;至24周时发现，侧支血管数目明显增加，血流灌注恢复。随诊期间静息痛及行走疼痛也明显改善。下肢注射外周血MNCs其踝臂指数轻微增加。

　　移植细胞治疗似乎是安全的，以上研究未出现心脏症状加重或其他不良心脏事件，包括致心律失常或支架内再狭窄。

　　虽然EPCs在治疗领域应用的初步研究结果令人鼓舞，但有关EPCs治疗的临床研究试验设计方面还存在很多重要问题：

　　(1)应选择何种细胞群移植，选择骨髓还是外周血作为细胞来源

　　何种祖细胞群对缺血组织有更强大的刺激血管新生和再生能力目前尚无令人信服的支持证据。事实上，CD34+干细胞组分参与出生后血管再生，另一方面CD34302细胞可增加CD34+细胞介导的血管再生。虽然此过程的机制尚不清楚，但可能与分泌促血管生成细胞因子和化学趋化因子或骨髓间充质干细胞和基质细胞转化为内皮细胞系、心肌细胞和平滑肌细胞有关。因此姑且认为骨髓MNCs中不同种类的细胞参与了坏死心肌和血管的再生并增加其潜在的再生能力。反言之，动员自骨髓的外周血祖细胞可能具有更强的功能活性。

　　(2)何种注入方式最有效

　　EPCs为数量极少的细胞群，静脉输注仅小部分细胞可到达靶区域。应选择恰当的注入方式为坏死区域提供最大细胞浓度。冠状动脉旁路移植术中梗死区域边界注射祖细胞、外周血管疾病腓肠肌直接注射、冠状动脉内输注或内膜转导心肌注射均为可行方式。然而，由于样本数量小，缺乏对照研究，以上方式何为恰当尚不能定论。

　　(3)急性缺血状态下，何时为细胞移植的最佳时间点

　　心肌梗死炎症反应的峰值时间为第1天，大量细胞因子、生长因子或细胞基质蛋白释放参与心肌修复。这些分子参与骨髓祖细胞的动员、分化和定位等自然过程。此时期进行活性祖细胞移植可能扩大炎症在心肌再生过程中的不良作用。研究也发现心肌梗死后第1天行骨髓MNCs移植对左室功能无改善。目前的临床试验细胞移植时间从4～10 d，最长3个月不等，结果已证实其合理性，但仍需大规模多中心试验进一步证实。

　　展望

　　以上研究结果初步显示，骨髓祖细胞移植在治疗心肌梗死和肢体缺血方面的可行性和安全性，未发现该治疗存在严重并发症。但还存在不足：研究中患者样本过少、随机非双盲、研究中心太少等。更为理想的是，应检测细胞群为何种特异的细胞群或混合细胞群。无论既往研究结果多么鼓舞人心，仍需要进行大规模多中心对照试验。细胞治疗的安全性和可行性仍需长期随访结果来证实。

　　在大规模临床试验中应用EPCs还存在一些障碍。首先EPCs数量较少，从外周血中扩增有效、明确的细胞亚群几乎不可能。其次体外扩增祖细胞可能存在表型变化、分化及细胞衰老的风险，需要人为的提前激活或刺激细胞。最后，理论上移植细胞可能聚集于肿瘤和视网膜，存在血管异常增生的风险。

　　更好地了解EPCs生物学特性及其动员、移行、EPCs定位的准确机制，有助于细胞准备和选择恰当的输送方式。应考虑基因细胞联合治疗。例如在移植前非体内转染VEGF于EPCs，可改善下肢缺血模型EPCs的能力，增加新生血管形成。EPC的生物学特性可通过基因修饰增强，导入载体表达使抗增殖、抗血栓形成或血管扩张基因过表达。这些可能改善移植细胞在损伤血管或修补物的功能、防止血栓形成和再狭窄，甚至可能增加促血管生成因子的产生，改善缺血区域的灌注。内源性EPCs动员可能为另一增加出生后血管生成的途径，与EPCs基因修饰联合可起协同作用。