血管紧张素原和内皮型一氧化氮合酶基因多态性与高血压病的相关性

　　作者：梁茜 杨希立 杨光 崔金环 作者单位：广东省佛山市第一人民医院心内科，广东 佛山 528000;广东省佛山市第一人民医院临床研究所，广东 佛山 528000

　　【摘要】目的 探讨血管紧张素原(AGT)M235T基因、内皮型一氧化氮合酶(eNOS) G894T基因多态性与原发性高血压(EH)的关系。方法 采用基因芯片技术检测224例(EH组和对照组)AGT和eNOS基因的多态性，并比较两组基因型和等位基因频率。结果 EH组AGT TT基因型携带者频率(74.19%)显著高于对照组(55.00%)，χ2=9.04，P<0.01。EH组eNOS-GT+TT基因型频率(12.90%)与对照组(15.00%)相比差异无显著性(P>0.05)。结论 AGT-TT基因多态性可能是中国人高血压病的独立危险因素，eNOS基因G894T多态性可能不是高血压病的独立危险因素。基因芯片技术为研究多种易感基因与高血压病的相关性提供了一项高效、敏感的方法。

　　【关键词】 原发性高血压 血管紧张素原 一氧化氮合酶 基因

　　Association of angiotensinogen and endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism with essential hypertension

　　LIANG Xi，YANG Xi-li，YANG Guang，CUI Jin-huan

　　(Department of Cardiology，First People’s Hospital of Foshan City，Foshan，Guangdong 528000， P.R.China; Department of Clinical Research，First People’s Hospital of Foshan City，Foshan，Guangdong 528000，P.R.China)

　　Abstract： Objective To evaluate the involvement of angiotensinogen (AGT) M235T gene and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) G894Tgene polymorphism in the development of essential hypertension (EH). Methods The study included 224 subjects (124 patients with EH and 100 controls).A gene chip technology was used to detect the level of AGT and eNOS gene polymorphisms.Comparison of EH patients vs.the controls in allele frequency and genotype distribution was conducted. Results A significantly higher frequency of the genotype of AGT TT gene was observed in the EH group (74.19% vs.55.00%，χ2=9.04，P<0.01).The gene polymorphism correlated positively to EH.No statistically significant difference was observed in eNOS GT+TT genotypes distribution between the two groups (12.90% vs.15.00%，P>0.05). Conclusion The AGT-TT gene polymorphism，not eNOS G894T，may be an independent risk factor of EH in China.Gene chip technology provides an effective and sensitive method to study the relationship of gene polymorphism and EH.

　　Key words： essential hypertension; angiotensinogen; nitric-oxide synthase; genes

　　高血压病是中国当今患病率、致残率和病死率很高的疾病，其发病是遗传和环境因素共同作用的结果，携带多种易感基因的人群高血压病的危险性明显升高。使用基因芯片对于多基因病，基因多态性联合分析比单一基因更有价值。高血压病的易感基因可能包括血管紧张素原(AGT)基因、与内皮功能失调有关的内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 基因等。本组旨在探讨AGT M235T、eNOS G894T基因多态性与高血压病之间的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 病例组(EH组)为佛山地区汉族高血压病患者124例，选自2004年8月～2005年5月住院病例，符合WHO关于高血压病的诊断标准，收缩压>18.62kPa，或舒张压>11.97kPa。男88例，女36例，年龄62±8岁。对照组100例：健康体检者，除外继发性高血压、心肌病、瓣膜性心脏病和先天性心脏病者。男74例，女26例，年龄63±9岁。对照组和EH组相比，年龄和性别构成差异均无显著性(P>0.05)。

　　1.2 实验方法 由上海百傲科技有限公司提供BaiO BE系列基因芯片检测仪和基因芯片检测所需的试剂。

　　1.2.1 人基因组DNA的提取及体外扩增 被检者抽取肘静脉血2ml，用EDTA抗凝，用快速裂解法提取基因组DNA。

　　1.2.2 采用PCR扩增AGT和eNOS基因的特异片段 ①分别在各扩增液管中加入Taq酶管溶液0.8ml;②在各扩增液管中分别加入阴性对照管溶液、阳性对照管溶液或抽提好的样品上清液，混匀;③把各管放入PCR仪中，按下列条件扩增：94℃25s，56℃25s，72℃25s，做40个循环，最后72℃5s;④取各管PCR扩增产物于98℃热变性5min，取出后迅速放入冰盒，-20℃放置。

　　1.2.3 杂交 在杂交舱中基因芯片与已变性PCR扩增产物混合物混匀杂交。

　　1.2.4 显色 向杂交舱中加入显色液溶液，44℃放置40min。

　　1.2.5 检测 将显色载玻片置于BaiO基因识读仪上进行检测，图像Array Doctor 软件分析可自动输出检测结果，最后检测出AGT、eNOS基因的多态性位点。

　　1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0 软件包作统计学处理，根据资料要求采用基因计数法计算各组病例及对照组的基因型和等位基因频率。EH组及对照组各组基因型和等位基因频率之间的比较用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 EH组及对照组的基因型频率适合度检测，显示皆达到Hardy-Weinberg平衡。

　　2.2 AGT基因型 EH组AGT TT基因型频率(74.19%)与对照组(55.00%)相比差异有高度显著性(P<0.01)，TT基因型与高血压病有关。两组T等位基因频率差异亦有显著性(P<0.05)，见表1。

　　表1 EH组和对照组AGT基因型与等位基因频率的分布(略)

　　与对照组比较，a：χ2=4.63，P<0.05;b：χ2=9.04，P<0.01

　　2.3 eNOS基因型 EH组eNOS-TT+GT基因型频率(12.90%)与对照组(15.00%)相比差异无显著性(χ2=0.20，P>0.05)。TT基因型与高血压无关，两组T等位基因频率差异无显著性(P>0.05)，见表2。

　　表2 EH组和对照组eNOS基因型与等位基因频率的分布(略)

　　与对照组比较，a：χ2=0.0003，P>0.05;b：χ2=0.20，P>0.05

　　2.4 多因素Logistic回归分析 将AGT基因、eNOS基因多态性、年龄、性别、体重指数作为自变量，高血压病作为应变量，进行逐步回归分析。结果显示 AGT基因的TT基因型与EH明显相关(P<0.01)，提示AGT TT基因型可能是EH的独立危险因素。

　　3 讨论

　　研究表明[1]，血浆AGT水平与AGT的基因型有一定的关系。AGT基因多态性通过改变血浆AGT水平影响血压水平。另外，AGT基因多态性引起的血浆AGT的变化又可引起血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平的过度增高。AGT基因多态性还可影响肾内的AngⅡ水平，使肾脏对AngⅡ的反应减弱，在高血压的发病中起着较为重要的作用。血管紧张素Ⅱ与其受体结合产生各种生物效应，从而导致血管阻力增加，心排血量增加，并能刺激醛固酮释放导致钠水潴留，并刺激心肌和血管平滑肌增生，从而使血压升高，心脏后负荷增加，甚至心肌肥厚，目前认为肾素血管紧张素系统在EH发病中起着非常重要的作用[2]。

　　Jeunemaitre等[1]对两个独立群体美国盐湖城和法国巴黎原发性高血压家系379个成员进行高血压相关基因的研究，证明AGT基因与高血压连锁，AGT M235T多态性与高血压病相关，且与AGT水平亦相关[3]。Caulfield等[4]研究了英国人群中的EH病例，也发现AGT基因与EH连锁，但未能证实M235T变异型与EH相关。本次对中国南方汉族人群进行的AGT基因多态性分析显示，AGT TT基因型的检出率在EH患者和正常人群之间差异有显著性，两组TT基因型频率分别为74.19%和55.00%，前者明显高于后者(P<0.01)，两组T等位基因频率差异也有显著性(P<0.05)，进一步证实了T等位基因和EH有关，提示AGT基因多态性可能是高血压病的遗传因素。

　　eNOS是左旋精氨酸一氧化氮途径的关键酶，eNOS催化生成的一氧化氮具有舒张血管、调节血流、阻止肾素—血管紧张素的产生、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板聚集、粘附和白细胞的趋化激活的作用[5]。eNOS基因第7个外显子的突变即894位碱基G突变成T(G894T)，导致Glu298Asp的错义，此突变影响eNOS酶功能，使NO生成减少或活性减低，可导致血管内皮受损、动脉粥样硬化形成、血小板聚集、血管舒缩障碍，最终导致血压升高。Tesauro研究[6]发现带有Asp298的 eNOS基因转染细胞后可分裂成100kDa和35kDa的两个片段，通过内源性蛋白酶影响eNOS的功能，故可能参与了高血压病的发生和发展。但最近Golser等[7]使用纯化酵母表达系统研究Glu298Asp突变的功能特点，未发现野生型与突变型在L-精氨酸的亲和力、最大反应速度及钙调蛋白的亲和力等方面差异有显著性。

　　Miyamoto[8]发现eNOS基因Glu298Asp突变和原发性高血压强烈相关，然而Kato[9]的一项大规模研究(549例EH和513正常对照)显示Glu298Asp突变与高血压无相关。Bonnardeaux等[10]的研究亦未能显示eNOS基因和高血压病有遗传连锁。本组对224例(包括124例EH患者和100例正常对照者)中国南方汉族人群进行eNOS基因多态性分析，结果显示EH组eNOS的GT+TT基因型频率和T 等位基因频率与正常组相比差异无显著性，提示eNOS基因Glu298Asp突变和原发性高血压无关，与Kato等[9]报道的结果相符。

　　多因素Logistic回归分析显示 AGT TT基因型是高血压病的独立危险因素。总之，基因突变对表型的作用在很大程度上受基因之间的相互作用及环境因素的影响，只有当基因突变所产生的微小表型效应积累到一定程度，加上因素环境的才会导致疾病的发生。高血压病是多基因疾病，本组使用基因芯片技术对eNOS G894T和AGT M235T基因多态性进行分析，更利于筛选高血压病的易感基因，下一步我们将增加多种高血压病候选基因的研究，以期对高血压病的药物治疗有指导意义。

　　【参考文献】

　　[1] Jeunemaitre X，Soubrier F，Kotelevtsev YV，et al.Molecular basis of human hypertension：role of angiotensinogen [J].Cell，1992，71(1)：169-180.

　　[2] 陈修.心血管药理学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，1989.239-248.

　　[3] Kunz R，Kreutz R，Beige J，et al.Association between the angiotensinogen 235T-variant and essential hypertension in whites： a systematic review and methodological appraisal [J].Hypertension，1997，30(6)：1331-1337.

　　[4] Caulfield M，Lavender P，Farrall M，et al.Linkage of the angiotensinogen gene to essential hypertension [J].New Engl J Med，1994，330(23)：1629-1633.

　　[5] Lefer AM.Nitric oxide：nature’s naturally occurring leukocyte inhibitor [J].Circulation，1997，95(3)：553-554.

　　[6] Tesauro M，Thompson WC，Rongliani P，et al.Intracellular processing of endothelial nitric oxide synthase isoforms associated with differences in severity of diopulmonary disease： Cleavage of proteins with aspartate VS.Glutamate at position 298 [J].Proceedings of National Academy Science of USA，2000，97(6)：2832-2835.

　　[7] Golser R，Gprren AC，Mayer B，et al.Functional characterization of glu298Asp mutant human endothelial nitric oxide synthase purifies from a yeast expression system [J].Nitric Oxide，2003，8(1)：7-14.

　　[8] Miyamoto Y，Saito Y，Kajiyama N，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension [J].Hypertension，1998，38(1)：3-8.

　　[9] Kato N，Sugiyama T，Morita H，et al.Lack of evidence for association between the endothelial nitric oxide synthase gene and hypertension [J].Hypertension，1999，39(4)：933-936.

　　[10] Bonnardeaux A，Nandaud S，Charru A，et al.Lack of evidence for linkage of the endothelial cell nitric oxide synthase gene to essential hypertension [J].Circulation，1995，91(1)：96-102.