ACE2基因A9570G多态性与2型糖尿病及糖尿病心肌病的相关性研究

　　作者：吴翔 李志梁 徐春生 陈文忠 冯巧飞 作者单位：南方医科大学附属珠江医院心内科，广东 广州 510280

　　【摘要】目的 探讨血管紧张素转化酶2(angiotensin l converting enzyme 2,ACE2) 基因A9570G多态性与2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)及糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的相关性。方法 选择广东地区无血缘关系的T2DM患者共358例,其中84例并发DMC,所有病人按是否并发DMC分为DMC组和DM组,应用聚合酶链反应和限制性内切酶片段长度多态性的方法检测ACE2基因A9570G多态性，并结合临床、生化指标及超声心动图参数进行分析。结果 在男性,对照组和T2DM组等位基因频率及基因型构成差异无统计学意义(χ2=0.002,P=0.964)，但DCM组G等位基因频率/G基因型分布高于对照组及T2DM组，差异有统计学意义(χ2=4.409,P=0.036,χ2=6.105,P=0.013)。在女性,三组间等位基因频率及基因型构成差异无统计学意义(χ2=0.037,P=0.981及χ2=0.890,P=0.926)。根据不同基因型对DMC组患者进行亚组分析发现,男性G基因型患者反映心脏早期舒张功能的室间隔舒张末期厚度(IVSTd)值明显高于A等位基因，差异有统计学意义t=2.243,P=0.029);女性则未观察到这种差异(F=1.156,P=0.324)。结论 ACE2基因A9750G多态性可能与男性T2DM并发DCM的遗传易感性相关，并且与其早期舒张功能不全严重程度有一定关系。

　　【关键词】 血管紧张素转化酶2 基因多态性 A9570G 2型糖尿病 糖尿病心肌病

　　Association between the polymorphism of A9570G in angiotensin converting enzyme 2 gene and diabetic cardiomyopathy

　　WU Xiang, LI ZhiLiang, XU ChunSheng, et al.

　　Department of Cardiology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, Guangdong, China

　　【Abstract】 Objective To explore the association between the polymorphism of A9570G in angiotensin converting enzyme (ACE) 2 gene and type Ⅱ diabetes (T2DM) complicated with diabetic cardiomyopathy (DCM). Methods Of 358 nonsibship T2DM patients in Guangdong, 84 cases with DCM. All the patients were divided into DCM and DM groups according to if onset of DCM Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) were used to observe polymorphisms of ACE2 gene A9570G and genotyping to analyze combining with clinical, biochemical indicator and ultrasoundcardiogram parameters. Results There was no significant difference in allele frequencies and the construction of genetype frequencies in male subjects between control group and T2DM group (χ2=0.002, P=0.964) , but the G allele frequencies and G genotypes frequencies in DCM group were significantly higher than those of control group and T2DM group (χ2=4.409, P=0.036 and χ2=6.105, P=0.013); the allele frequencies and the construction of genetype in female subjects had no difference among three groups (χ2=0.037, P=0.981 and χ2=0.890, P=0.926). Subset analysis based on different genetypes in DCM group indicated that the interventricular septal enddiastolic thickness (IVSTd) in patients with G genetype was significantly higher than that in patients with A genetype in male (t=2.243, P=0.029), but this difference was not observed in female (F=1.156, P=0.324). Conclusions The polymorphism of A9570G in ACE2 gene may be associated with the genetic predisposition of T2DM complicated with DCM in male, and it is also associated with the severity of early diastolic dysfunction.

　　【Key words】 Angiotensin converting enzyme 2; Gene polymorphisms; A9570G; Type 2 diabetes; Diabetic cardiomyopathy

　　糖尿病心肌病(DCD)是与冠状动脉粥样硬化和高血压无关的独立的、特异的糖尿病心肌病，表现为心脏收缩和(或)舒张功能障碍。DCM发病机制十分复杂。肾素血管紧张素系统(RAS)过度激活参与DCM的发生〔1〕，DM及DCM的家庭聚集现象说明其发病具有遗传倾向。人类血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性可能与2型糖尿病(T2DM)微血管结构改变的发生相关〔 2，3〕,而微血管的改变是DCM的发生和进展的主要原因。血管紧张素转换酶2〔3〕 (ACE2)是2000年发现的RAS家族新成员,发挥与ACE相拮抗的作用。基础研究〔5〕发现，人类ACE2基因定位于染色体Xp22(5)，迄今已知该基因的单核苷酸多态性(single oligonucleotide polymorphism,SNP)位点有140个，其中研究较多的是位于第三内含子、紧靠外显子的G8790A多态性。目前关于ACE2基因多态性与DM及其并发症的关系尚不明确。本研究探讨ACE2 基因G8790A多态性与T2DM及DCM之间的相关性。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本来源 选取2005至2008年南方医科大学附属珠江医院诊断明确、广东地区汉族无血缘关系的358例T2DM患者为研究对象,男185例,女173例。其诊断和分型依照1999 年WHO/WPR 标准,所有患者均接受彩色多普勒超声、常规12导联心电图或运动心电图、动态心电图检查，部分病例行冠状动脉造影或64层螺旋CT冠状动脉血管成像。所有患者化验HbA1c、血脂、肾功能等;记录血压、体重指数。诊断为心脏收缩和(或)舒张功能不全,符合除外高血压病、冠心病等能影响心功能疾病的T2DM患者为DCM组,共84例,男40例,女44例,其余为T2DM组,共274例,男126例,女148例。正常对照组100例，为健康体检者，经详细的病史询问、体格检查以及胸片、标准12 导联心电图、B 超、血尿粪常规、血生化检查均未见异常,除外有心血管病或糖尿病者,男50例、女50例。收集并统计分析所有研究对象的一般临床资料。

　　1.2 ACE2基因型分折

　　1.2.1 DNA提取 空腹抽取静脉血2 ml，采用Tiangen公司提供的外周血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，紫外分光光度计测定DNA浓度,并标化DNA浓度值至20 mg/L,溶于TE中，-80℃冻存，待PCR扩增。

　　1.2.2 引物设计 在美国国立生物技术信息数据库获得ACE2基因组序列,Genebank 序号为AY217547.1。利用Oligo程序设计引物,上游引物序列为：5′CATGTGGTCAAAAGGATATCT3′，下游引物序列为：5′AAAGTAAGGTTGGCAGACAT3′。由北京三博远志技术有限责任公司合成引物。

　　1.2.3 DNA扩增 采用25 μl反应体系，反应体系包括:10×buffer(含Mg2+)2 μl，10 μmol /L 上、下游引物各0.5 μl,10 mmol/L三磷酸脱氧核苷1.6 μl,基因组DNA 20 ng，5 U/L Taq DNA聚合酶0.2 μl，消毒双蒸水19.2 μl。应用美国GeneAmp 9600 聚合酶链式反应扩增仪扩增目的基因。PCR反应条件为：94℃预变性1 min，94℃变性40 s,58.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，32 个循环，72℃延伸加时7 min 以终止所有反应。PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证。

　　1.2.4 ACE2 基因多态性检测 采用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)的方法进行基因分型，针对ACE2A9570G多态性，选用AluⅠ进行酶切,酶切位点为5′AG▽CT3′(购自New England Biolabs公司)。酶切反应体系20 μl，包括：特异性PCR 扩增产物8 μl，AluⅠ酶1 U，10×buffer(AluⅠ酶自带) 2 μl，消毒双蒸水9 μl。酶切温度：37℃，酶切时间：16 h。酶切产物点样于2%琼脂糖凝胶，以50 bp梯度标志作为判断DNA 片段大小的标准物,100 V 电泳35 min，在紫外灯下观察电泳条带以鉴定基因型。对各基因型随机抽样测序(Invitrogen 生物技术有限公司) 核实基因型。

　　1.3 统计学分析 由于ACE2基因位于x染色体上，故按照性别分别进行统计分析。采用Spss13.0统汁学软件，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验,遗传平衡检验采用HardyWeinberg 平衡定律。

　　2 结果

　　2.1 一般资料分析 按性别分别统计分析，3组间年龄、体重指数差异无统计学意义。与对照组比较，DM组和DCM组的其他指标差异均有统计学意义，而DM组和DCM组比较差异无统计学意义(见表1)。

　　表1 一般资料比较(略)

　　与对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01

　　2.2 ACE2基因型测序及酶切电泳结果 测序结果(见图1)证实ACE2A9570G多态性位于第3内含子第4碱基，正好是限制性内切酶AluⅠ的酶切位点(5′AG▽CT3′)。A基因型的PCR 产物被酶切成261 bp 和185 bp 两个片段，G基因型的产物不能被酶切，电泳时仅有1个片段,长度为446 bp,而G/A杂合子表现为同时具有3个条带(见图2)。

　　2.3 ACE2基因型和等位基因频率分析 在女性群体经检验符合HardyWeinberg平衡(χ2=0.046,P>0.05),说明样本的代表性好;按性别进行分类分析,在男性,三组间等位基因频率/基因型分布比较差异有统计学意义(χ2=6.478,P=0.039)，进一步分析发现，男性 DCM组G等位基因频率/G基因型分布高于对照组及T2DM组，差异有统计学意义(χ2=4.409,P=0.036,χ2=6.105,P=0.013)而对照组和T2DM组等位基因频率及基因型构成差异无统计学意义(χ2=0.002,P=0.964)。在女性,三组间等位基因频率及基因型构成差异无统计学意义(χ2=0.037,P=0.981及χ2=0.890,P=0.926)(见表2)。

　　2.4 ACE2基因型与DCM患者心功能受损程度的关系 不同基因型之间左室射血分数(LVEF)，左心室后壁收缩末厚度(LVPWTd),左心室后壁舒张末厚度(LVPWTd),左室舒张末内径(LVEDd)差异均无统计学意义。男性DCM组患者,G基因型室间隔舒张末厚度(IVSTd)高于A基因型,且差异有统计学意义(t=2.243,P=0.029);女性DCM组患者不同基因型之间，IVSTd差异无统计学意义(F=1.156,P=0.324)(见表3)。

　　图中斜体部分为多态性位点,纯合子呈单峰,杂合子呈双峰

　　图1 ACE2基因A9570G多态测序图(略)

　　表2 ACE2 基因型和等位基因分布(略)

　　与对照组比较：1)P<0.05;与DM组比较：2)P<0.05

　　图2 酶切电泳条带(略)

　　表3 ACE2不同基因型DCM患者超声心动图参数的比较(略)

　　在男性DCM组,与A基因型相比：1)P<0.05

　　3 讨论

　　在迄今为止ACE2基因G8790A多态性与疾病相关性的研究中,Frojdo 等〔6〕观察到芬兰1型糖尿病人群中ACE2 基因G8790A位点的SNP与糖尿病性肾病无关联;Benjafield 等〔7〕研究了含G8790A在内的4个SNP位点与原发性高血压的关系，未发现阳性关联。来自汉族人的研究结果则有所不同。钟健等〔4〕研究认为ACE2基因A9570G多态性与糖尿病及高血压肾脏损害相关。近有报道〔8〕，ACE2基因G8790A 位点与代谢综合症病人的血压升高相关。刘同宝等〔9〕观察了ACE2 基因G8790A多态性与华北汉族人原发性高血压的关系，发现高血压组和对照组G与A基因型分布无显著差异，但高血压伴心功能不全组A基因型频率显著高于对照组。现有研究提示，ACE2基因多态性与疾病的关联可能存在种族差异;汉族人群中ACE2基因可能为某些疾病的遗传易感基因。

　　由于ACE2基因位于X染色体上,按性别分别对各组间等位基因及基因型频率进行统计分析。在男性,对照组和DM组等位基因及基因型频率构成差异无统计学意义(χ2=0.024,P=0.876);DCM组G等位基因及基因型频率高于对照组及DM组(χ2=4.781,P=0.029 and χ2=4.933,P=0.026)。在女性,三组间等位基因及基因型频率构成差异无统计学意义(χ2=0.037,P=0.981 and χ2=1.243,P=0.871)。提示ACE2基因A9570G多态性可能与男性T2DM患者并发DCM相关。根据不同基因型对DCM组患者的超声心动图参数进行亚组分析发现，不同基因型之间LVEF，E/A，LVPWTd，LVEDd差异均无统计学意义。在男性，G基因型室间IVSTd高于A基因型,且差异有统计学意义(t=2.243,P=0.029);女性DCM组患者不同基因型之间，IVSTd差异无统计学意义(F=1.156,P=0.324),提示ACE2基因G8790A多态性可能与男性DCM患者早期左室舒张功能障碍(left ventricular diastolic dysfunction，LVDD)的程度有关。愈来愈多的证据表明〔10，11〕，左室舒张功能障碍是DCM的早期表现,而IVSTd是衡量左室早期舒张功能异常的重要指标。对于这种性别差异的现象推测与ACE2基因的定位有关，ACE2基因位于x染色体，而女性有两条x染色体，这可能是其在不同性别中所起的作用有所差别的原因。ACE2基因A9570G多态性如何影响DCM的发生及左室舒张功能目前尚不清楚，进一步揭示其对ACE2基因表达和功能的影响将有助于部分阐明DCM发病机制，为DCM及其舒张功能障碍的早期干预提供理论依据。

　　本研究肯定了ACE2基因A9570G多态性在男性DCM及其舒张功能障碍的程度中的作用，但T2DM及其心肌损伤的发生受多基因，多种因素的影响，单个因素的影响可能是微小的。这种影响可能由于基因与基因、基因与环境的相互作用而增加或减弱，因此尚需要进一步与其他基因联合探讨，才能最终确定其在T2DM及DCM遗传易感性中的作用。

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