重组人高密度脂蛋白Ｂ族Ｉ型清道夫受体基因腺相关病毒血清型２／１杂合载体在ＨｅｐＧ２肝细胞的表达

　　作者：张玉玲，伍卫，周淑娴，雷娟 作者单位：附属第二医院心血管内科， 广东 广州 510120; 2. 附属第五医院心血管内科， 广东 珠海 519000

　　【摘要】 构建含绿色荧光蛋白(EGFP)重组人高密度脂蛋白B族I型清道夫受体(SR-BI)基因腺相关病毒(rAAV)2/1杂合载体，观察其在HepG2肝细胞的表达。【方法】以pCMV.SPORT6-SR-BI质粒为模板PCR扩增目的基因cDNA，将其克隆至pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa载体中，经酶切及测序鉴定后，脂质体介导转染BHK21细胞，经G418筛选得到含SR-BI基因的BHK/SR-BI-IRES-EGFP载体细胞株，用携带rep2-cap1基因的辅助病毒(rHsv/r2cl)感染该细胞株。通过细胞孵育、裂解和病毒纯化，得到杂合载体rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒。免疫荧光显微镜检测绿色荧光表达，计算转染效率，Western Blot检测转染后SR-BI蛋白的表达。 【结果】 酶切鉴定表明pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP重组成功，基因测序显示装入pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa质粒中的SR-BI基因正确;成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒载体。转染HepG2肝细胞后免疫荧光显微镜检测最佳MOI值为1 × 105时， 以此值转染HepG2肝细胞荧光高效表达; Western Blot检测未转染组及rAAV2/1-IRES-EGFP组HepG2肝细胞均有SR-BI蛋白表达，rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP组SR-BI蛋白表达水平较rAAV2/1-IRES-EGFP组及未转染组显著增加。【结论】 成功构建了rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP杂合载体系统，转染后SR-BI蛋白在HepG2肝细胞高效表达，为SR-BI生理学作用机制及临床应用的深入研究奠定基础.

　　【关键词】 高密度脂蛋白; B族I型清道夫受体; 腺相关病毒; HepG2肝细胞

　　Expression of Adeno-associated Virus Vector Serotype 2/1 Containing HumanScavenger Receptor Class B Type I Gene and Its Expressionin in HepG2 Hepatoma Cells　ZHANG Yu-ling， WU Wei， ZHOU Shu-xian， LEI Juan　1. Department of Cardiology， The Second Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China;. Department of Cardiology， The Fifth Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Zhuhai 519000， China　Abstract： 【Objective】 The recombinant adeno-associated virus serotype 2/1 (rAAV2/1) hybrid vector containing human scavenger receptor class B type I gene (SR-BI) was constructed and its expression was examined in human HepG2 hepatoma cells.【Methods】 The SR-BI cDNA which was obtained by PCR from pCMV.SPORT6-SR-BI plasmid was inserted into the AAV vector plasmid pSNAV2.0 -IRES-EGFP-LacZa. The recombinant plasmid pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP was transfected into BHK21 cells by LipofactamineTM2000 after being identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. The rAAV vector producing cells were selected with G418. The G418 resistant cells were infected by helper recombinant rHSV/rep2cap1 viruses containing rep gene from AAV2 and cap gene from AAV1. The Cells were cultured and purified to obtain rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP. The expression of recombinant vectors rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP in human HepG2 hepatoma cells was examined by immunofluorescent microscopy and Western blot analysis. 【Results】 The recombinant plasmid pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP was confirmed by digestion with restriction enzyme and the sequence of subcloned SR-BI cDNA was identical with that published on GenBank. The hybrid vectors rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP was successfully constructed. The best MOI value in HepG2 hepatoma cells was 1 × 105. The fluorescence was highly expressed after transfected in HepG2 hepatoma cells. Higher levels of SR-BI proteingene expression approach to atherosclerosis diseases.

　　Key words： High density lipoprotein; Scavenger receptor class B type I receptor; Adeno-associated virus; human HepG2 hepatoma cells

　　冠心病是发达国家和大多数发展中国家首要的死亡原因，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病的主要病理基础，高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C)水平与冠心病的发病呈负相关[1]，HDL通过参与胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport， RCT)而影响了AS的发生[2]，HDL B族I型清道夫受体(scavenger receptor class B type I， SR-BI)在RCT过程中起关键作用，研究表明SR-BI基因表达增加，可以通过增加RCT而减少AS[3]。腺相关病毒载体(adeno-associated viral vector，AAV vector)是目前最安全的病毒载体，血清型2的重组腺相关病毒载体(rAAV2)携带治疗基因可纠正多种基因缺陷，但正常人群中85%存在AAV2的抗体[4]。而重组血清型1的腺相关病毒(rAAV1)对肝细胞及骨骼肌则有更高的转导效率，可以转导外源基因在实质脏器持续稳定表达[5]。rAAV2/1具有AAV2的ITR和AAV1的外壳，感染特性与AAV1一致，可避免抗AAV2抗体产生的干扰[6]。目前尚未见将rAAV2/1应用于SR-BI基因转导的报道。本实验拟构建重组人B族I型清道夫受体基因rAAV2/1杂合载体，并转染人HepG2肝细胞，观察其在HepG2肝细胞的表达，为SR-BI生理学作用机制及临床应用的深入研究莫定基础，为动脉粥样硬化的防治研究提供新方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　含人B族I型清道夫受体基因的真核表达质粒pCMV.SPORT6-SR-BI购自中晶生物(openbiosystem产品)，包装质粒pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa及携带rep2-cap1基因的辅助病毒rHsv/r2cl由北京本元正阳基因公司提供。大肠杆菌DH-5α及含100 mL/L胎牛血清的PRMI 1640培养液购自GIBCO/BRL公司， T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ购自Biolab/BRL公司。V-gene质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司，LipofactamineTM购自GIBCO/BRL公司，HepG2肝细胞购自ATCC。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 含SR-BI基因的重组质粒pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP的构建及鉴定

　　根据GenBank中人SR-BI的基因序列设计引物，上游引物SR-AgeI-1550-F 5′-GCCAACCGGTATGGGCGGCAGCT CCAGG-3′，下游引物BI-NheI-1550-R 5′-CTGCGC TAGCTATAGCTTGGCTTCTTGCAG-3′，上游引入AgeI 位点，下游引入NheI酶切位点，以pCMV.SPORT6-SR-BI为模板扩增目的基因，PCR得到SR-BI的cDNA，pCMV.SPORT6-SR-BI质粒经PCR鉴定。

　　应用AgeI和NheI限制性内切酶双酶切载体质粒 pSNAV2.0-IRES-EGFP-LacZa和目的基因SR-BI的PCR产物，回收约8.4 kb的pSNAV2.0- IRES-EGFP载体片段和1.5 kb的SR-BI目的基因片段。T4 DNA连接酶25 ℃室温连接1 h。连接产物热休克法转化入感受态大肠杆菌DH-5α，挑取单克隆菌落37 ℃摇床振荡培养18 h，以V-gene质粒提取试剂盒提取质粒，所得的重组质粒命名为pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP。引入上述PCR反应体系行PCR反应鉴定，AgeI + NheI双酶切鉴定重组pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP质粒。对经PCR和酶切鉴定正确的重组pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP质粒进一步进行测序鉴定。

　　1.2.2 rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP的制备及纯度与滴度的测定

　　按LipofactamineTM2000说明书提供的方法，用脂质体将pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP质粒转染BHK-21细胞，24 h后用含G418(800 μg/mL)的培养基筛选培养，待抗性克隆形成后，用2.5 g/L胰酶消化传代，继续用G418选择培养，将该细胞株命名为BHK/SR-BI-IRES-EGFP载体细胞株。

　　用25 cm2含100 mL/L胎牛血清的1640培养基培养载体细胞株，细胞达到80%融合时用携带rep2-cap1基因的辅助病毒rHsv/r2cl感染(MOI为0.1)细胞株，48 h完全病变后，反复冻融细胞，1 000 r/min(r = 12 cm)离心5 min，去除细胞碎片，收集上清。然后置56 ℃水浴30 min，灭活辅助病毒rHsv/r2cl，得到载体rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒。PCR鉴定重组rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒，SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)检测纯度，滴度测定采用地高辛标记点杂交法[7]。

　　1.2.3 rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP在HepG2肝细胞的表达

　　以每孔1 × 105个细胞接种于24孔板中，加入含100 mL/L胎牛血清的1640培养基，于37 ℃体积分数为5%的CO2孵箱中培养。培养至60%融合时，弃去培养上清，按感染复数分别为1 × 104、5 × 104、1 × 105、5 × 105加入，rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP病毒悬液，8 h后吸出病毒液，加入普通培养基继续培养，分别于24 h，48 h，72 h，96 h，7 d在荧光显微镜下观察转化效率，即绿色荧光蛋白阳性细胞数/细胞总数。提取病毒转染后72 h的HepG2肝细胞按每20 mg组织加150 μL裂解液加入匀浆器匀浆， 4 ℃ 12 000 r/min(r = 12 cm)离心20 min，取上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。取35 μg蛋白上样，经12% SDS-聚丙烯酰胺凝电泳分离，转移至0.22 μm的醋酸纤维素膜上，50 g/L脱脂奶粉37 ℃封闭3 h，分别加入1 ∶ 1 000的兔抗SR-BI单克隆抗体和1 ∶ 100的兔抗β-actin抗体，4 ℃过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔的二抗进行蛋白杂交检测，ECL显色试剂盒显色。

　　1.2.4 统计分析

　　用SPSS 13.0软件进行统计学分析。数据采用均数 ± 标准差表示，多组间均数的比较用单因素方差分析，有统计学意义者用LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 原始质粒pCMV.SPORT6-SR-BI的PCR电泳鉴定

　　pCMV.SPORT6-SR-BI经PCR扩增可以扩增出1 550 bp大小cDNA的片段，与GenBank中hSR-BI cDNA序列一致(图1)。

　　2.2 重组pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP质粒的PCR、酶切及测序鉴定

　　重组质粒pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP经PCR扩增电泳条带条带大小约1 550 bp，与预期结果相同，说明这些质粒中含有目的基因SR-BI(图2)。AgeI + NheI双酶切pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP质粒能获得大小约8.4 kb和1.5 kb的条带，从电泳图中看酶切条带大小与预期结果相同，酶切鉴定正确(图3)，表明重组pSNAV2.0-SR-BI-IRES-EGFP质粒构建成功。测序结果表明拼接序列与GenBANK提供全序列一致，装入PSNAV质粒中的SR-BI基因是正确的。

　　2.3 重组rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP载体鉴定及纯度与滴度测定

　　重组rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP载体病毒PCR结果能够特异地扩增出1 550 bp大小的目的基因条带，证明该重组腺病毒携带目的基因SR-BI(图4)。用SDS-PAGE电泳分析rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP的纯度，表现为3条特征性的蛋白条带，无其他杂带，表明病毒载体的纯度在95%以上。用地高辛标记的点杂交方法计算出rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP的大致滴度为1.5 × 1012 μg/mL。

　　2.4 rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP在HepG2肝细胞的表达

　　以纯化的rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP感染HepG2肝细胞，当感染复数为1 × 105时，72 h感染效率可达86%;当感染复数为5 × 105时，感染效率与1 × 105差异无显著性(P > 0.05)，因此重组rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP对HepG2肝细胞的最佳感染复数为1 × 105(表1)。以此MOI值转染HepG2肝细胞24 h免疫荧光显微镜观察即可见到绿色荧光蛋白表达，72 h绿色荧光蛋白表达最强(图5)。

　　Western Blot结果显示，未转染组及对照病毒rAAV2/1-IRES-EGFP转染组HepG2肝细胞均有少量SR-BI蛋白的表达，而重组病毒rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP转染组SR-BI蛋白的表达明显增加，差异有显著性(P < 0.01，图6)。

　　3 讨 论

　　研究报道HDL低于35 mg/dl在男性中的发生率约为16% ～ 18%，女性约为3% ～ 6%，大量的流行病学资料[8-9]研究证明低HDL水平是冠心病的独立危险因素，如Framingham[9]研究中43% ～ 44% 的冠心病事件与HDL-C 低于40 mg/dL相关， HDL-C 低于35 mg/dL的个体冠心病事件的风险较HDL-C高于65 mg/dL增高8倍。但是HDL抗动脉粥样硬化的机制尚不清楚。

　　SR-BI最早是在从乙酰化LDL为配体克隆的清道夫受体家族中发现的，属清道夫受体家族B亚族I型，而人类SR-BI(hSR-BI)是作为CD36膜蛋白超家族及溶酶体整合膜蛋白相关蛋白被独立发现的，又称CLA-I ，1996年Acton等[10]发现SR-BI可与HDL高亲和性结合，介导HDL-C的选择性摄取，首次提出SR-BI是HDL的受体，SR-BI在体内各种组织如肝脏、肾上腺、卵巢及睾丸等广泛表达。

　　研究表明SR-BI通过影响RCT而具有抗动脉粥样硬化的功能[11]，RCT指外周组织中游离胆固醇的流向HDL，HDL脂蛋白经SR-BI介导转运至肝脏合成胆汁酸。如在LDL受体缺陷小鼠的肝细胞中过量表达SR-BI，喂饲高胆固醇食物后AS损伤明显低于未过量表达SR-BI的LDL受体缺陷小鼠[12];而在载脂蛋白E基因(Apo E)敲除小鼠中再敲除SR-BI基因将加速AS的发展[13]。但是SR-BI 抗AS机制及其在肝脏中的调节过程尚不清楚，应用基因工程技术将SR-BI基因重组入宿主细胞基因组中，使SR-BI获得持续的表达进一步研究其抗动脉粥样硬化的机制是这一领域中重要研究方向。

　　重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，广泛用于基因功能研究、基因治疗等方面[14]。目前已发现的AAV至少有8种血清型，即AAV1 ～ AAV8，它们主要区别在衣壳蛋白的不同，各种血清型AAV对不同的组织和细胞有不同的感染效率。目前通用的AAV载体都基于血清型2，但正常人群中有85%存在AAV2的抗体，而采用其它血清型的AAV病毒外壳，可以减少已有的抗体对AAV载体的影响[6]。AAV1载体在肌肉组织和肝脏中的转导效率较高。用AAV2的ITR，换上血清型AAV1的cap蛋白，就可以得到感染特性与AAV1一致rAAV2/1杂合载体[15]。

　　本研究首次构建了BHK/SR-BI-IRES-EGFP载体细胞株，用携带AAV的rep2-cap1基因的辅助病毒rHsv/r2cl感染己经整合了ITR-SR-BI-ITR的AAV包装细胞株，得到了携带SR-BI基因的rAAV2/1杂合载体。其中，rep2-cap1指来源于AAV2的rep和来源于AAV1的cap基因，由于含有来自AAV2的rep基因，该辅助病毒(rHsv/r2c1)可以识别并包装来自AAV2的ITR，得到的rAAV2/1杂合载体ITR来自AAV2，而外壳来自AAV1，采用这种方式制备的rAAV2/1杂合载体具有野生型AAV1的感染特性[15]。在人体临床基因治疗时可能避免已存在的抗AAV2抗体产生的干扰。

　　本研究将重组腺相关病毒rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP 杂合载体系统成功转染人HepG2肝细胞，转染后绿色荧光蛋白表达可以高效稳定表达，同时SR-BI蛋白表达显著增高，表明重组腺相关病毒rAAV2/1-SR-BI-IRES-EGFP 杂合载体能够高效的介导肝细胞的转染，为SR-BI在肝细胞中生物学作用机制及临床应用的深入研究奠定基础。

　　【参考文献】

　　[1]Hausenloy DJ， Yellon DM. Targeting residual cardiovascular risk： raising high-density lipoprotein cholesterol levels [J]. Heart， 2008， 94(6)：706-714.

　　[2]Lewis GF， Rader DJ. New insights into the regulation of HDL metabolism and reverse cholesterol transport[J]. Circ Res， 2005， 96(12)：1221-1232.

　　[3]Rhainds D， Brodeur M， Lapointe J， et al. The role of human and mouse hepatic scavenger receptor class B type I (SR-BI) in the selective uptake of low-density lipoprotein-cholesteryl esters [J]. Biochemistry， 2003， 42(24)： 7527-7538.

　　[4]Yamano S， Huang LY， Ding C， et al. Recombinant adeno-assoeiated virus serotype 2 vectors mediate stable interleukin 10 secretion from salivary glands into the bloodstream [J]. Hum Gene Ther， 2002， 13(2)： 287-298.

　　[5]Wang C， Wang CM， Clark KR， et al. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain[J]. Gene Ther， 2003， 10(17)：1528-1534.

　　[6]Hauck B， Xu RR， Xie J， et al. Efficient AAV1-AAV2 hybrid vector for gene therapy of hemophilia [J]. Hum Gene Ther， 2006， 17(1)： 46-54.

　　[7]吴小兵，董小岩，伍志坚，等. 一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法 [J]. 科学通报，2000，4(19)2071-2075.

　　[8]Sharrett AR， Ballantyne CM， Coady SA， et al. Coronary heart disease prediction from lipoprotein cholesterol levels， triglycerides， lipoprotein(a)， apolipoproteins A-I and B， and HDL density subfractions： the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study [J]. Circulation， 2001， 104(10)： 1108-1113.

　　[9]Castelli WP， Garrison RJ， Wilson PW， et al. Incidence of coronary heart disease and lipoprotein cholesterol levels： the Framingham Study [J]. JAMA， 1986， 256(20)： 2835-2838.

　　[10]Acton S， Rigotti A， Landschulz KT， et al. Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptor [J]. Science， 1996， 271(5248)： 518-520.

　　[11]Zhang Y， Ahmed AM， Tran TL， et al. The inhibition of endocytosis affects HDL-lipid uptake mediated by the human scavenger receptor class B type I [J]. Mol Membr Biol， 2007， 24(5-6)： 442-454.

　　[12]Arai T， Wang N， Bezouevski M， et al. Decreased atherosclerosis in heterozygous low density lipoprotein receptor deficient mice expressing the scavenger receptor BI transgene [J]. J Biol Chem， 1999， 274(4)： 2366-2371.

　　[13]Braun A， Trigatti BL， Post MJ， et al. Loss of SR-BI expression leads to the early onset of occlusive atherosclerotic coronary artery disease， spontaneous myocardial infarctions， severe cardiac dysfunction， and premature death in apolipoprotein E-deficient mice [J]. Circ Res， 2002， 90(3)： 270-276.

　　[14]Kilian EG， Eifert S， Beiras-Fernandez A， et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer in a rabit vein graft model[J]. Circ J， 2008， 72(10)：1700-1704.

　　[15]Sandalon Z， Bruckheimer EM， Lustig KH， et al. Long-term suppression of experimental arthritis following intramuscular administration of a pseudotyped AAV2/1-TNFR：Fc Vector [J]. Mol Ther， 2007， 15(2)： 264-269.