辛伐他汀影响内皮祖细胞数量、黏附及凋亡的研究

　　作者：周亚林,杨乃全,方翔，张雅莉，朱源生，梅介平 作者单位：徐州医学院附属淮安第二人民医院心脏内科，江苏淮安

　　【摘要】 目的 细胞水平观察不同浓度辛伐他汀对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)功能的影响。方法 采用密度梯度离心法从人外周血获取单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板上，培养7天后，收集贴壁细胞，通过激光共聚焦显微镜鉴定，FITC-UEA-I和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化EPCs。以不同浓度辛伐他汀(分别为0.0001、0.001、0.01、0.1、1.0 μmol/L)和EPCs培养。分别采用黏附能力测定实验、碘化丙啶(PI)标记观察辛伐他汀对EPCs黏附与凋亡的影响。结果 辛伐他汀显著提高了外周血EPCs的数量、黏附能力，并能抑制其凋亡。辛伐他汀浓度在0.01 μmol/L时对EPCs的数量、黏附功能和抗凋亡能力影响达到最大。随着药物浓度的继续增大，EPCs的上述功能反呈下降趋势，但0.1 μmol/L组仍高于对照组。结论 辛伐他汀能增加EPCs数量、黏附能力并能抑制其凋亡。

　　【关键词】 他汀类药物;内皮祖细胞;黏附;凋亡

　　Study on the effects of simvastatin on the number, adhesion and apoptosis

　　of endothelial progenitor cells

　　ZHOU Yalin,YANG Naiquan, FANG Xiang, ZHANG Yali, ZHU Yuansheng, MEI Jieping

　　(Department of Cardiovascular Diseases, The Affiliated Huai'an Second Hospital of Xuzhou Medical College,

　　Huai′an, Jiangsu 223001, China)

　　Abstract： Objective To investigate the effects of simvastatin on EPC number, adhesion and apoptosis. Methods Total mononuclear cells (MNCs) isolated from human peripheral blood by Ficoll density gradient centrifugation were plated on fibronectin-coated culture dishes. After 7 days of culture, attached cells were obtained and assessed with a laser scanning confocal microscope, and differentiating EPCs were characterized as adherent positive cells by double staining of DiLDL-uptake and lectin binding. EPCs were treated with simvastatin of different concentrations (0.0001, 0.001, 0.01, 0.1 and 1.0 μmol/L). EPC adhesion assay was performed by adherent cell counting on fibronectin-coated culture dishes. EPC apoptosis was evaluated by flow cytometry. Results Simvastatin promoted EPC number and adhesive capacity and prevented apoptosis . Simvastatin at 0.01 μmol/L had the maximum effects on EPCs number, adhesion and anti-apoptosis. While the concentration of simvastatin further increased more than 0.01μmol/L, the above improvement effects showed a tendency to decline, but the effects at 0.1 μmol/L concentration were still greater than those in control group. Conclusion The study establishes that simvastatin could improve EPCs number and adhesion and prevent apoptosis.

　　Key words： statins; endothelial progenitor cells; adhesion; apoptosis

　　越来越多的证据表明提高新生血管形成来恢复缺血组织的功能依赖于内皮祖细胞动员并整合到缺血组织。然而，循环血液中内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)数量有限(约占粒细胞的0.05%)[1]，尤其在老龄、冠心病、高血压、糖尿病等患者中,存在EPCs数量减少、功能不良以及易老化等问题,而这些人群又是EPCs移植的主要对象。所以, 如何提高EPCs的数量、增殖、迁移、黏附和抗凋亡能力对开展EPCs移植来说显得尤为重要。

　　β-羟-β-甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂(他汀类药物)除了能有效地调节血脂水平外，还具有抑制平滑肌增生和血小板聚集以及抑制炎症反应等作用。最近研究表明，他汀类药物还能促进血管新生和内皮损伤后的修复过程，而且已经证实EPCs在该过程中扮演了重要角色[2-4]。本研究在细胞水平探讨了辛伐他汀对EPCs数量、黏附和抗凋亡功能的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 血液样本来自成年男性健康志愿者(无吸烟嗜好，年龄20～41岁)。密度梯度离心法获取单个核细胞，将单个核细胞铺在包被有人纤维连接蛋白(Roche公司, 德国)的培养板上。以含20%胎牛血清(FBS)(Hyclone公司, 澳大利亚)的M199(JRH公司, 美国)培养4天，用PBS洗除非贴壁细胞，继培养至7天，再加PBS洗除非贴壁细胞，取贴壁细胞供实验用[5]。辛伐他汀由默克公司惠赠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 EPC鉴定 细胞与DiI-acLDL (2.4 mg/L) (DiI-acLDL，Biomedical公司, 美国) 37℃下孵育1h以检测EPCs对DiI-acLDL的摄取。然后2%多聚甲醛固定细胞10 min，固定后PBS浸洗，将FITC-UEA-I(10 mg/L) (UEA-I，Vector公司, 美国)加于上述标本于37℃下孵育1 h。在激光共聚焦显微镜下(laser scanning confocal microscope，LSCM,Zeiss公司,德国) UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs[1,6]。

　　1.2.2 实验分组 贴壁细胞随机分成7组：①对照组：以不含辛伐他汀培养基与EPCs共培养24 h。②辛伐他汀各浓度组(共5组)：以不同浓度辛伐他汀(分别为0.0001、0.001、0.01、0.1、1.0 μmol/L)与EPCs共培养24 h。

　　1.2.3 黏附能力检测 依照参考文献[3]的方法，用0.25%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，悬浮在500 μl培养液，计数。然后将同等数目的EPC接种在包被有人纤维连接蛋白的培养板，在37℃下培养30 min，计数贴壁细胞 。

　　1.2.4 凋亡功能检测 依照参考文献 [7]，以5%胎牛血清培养24 h诱导EPCs凋亡，收集贴壁和漂浮细胞，用PBS冲洗2遍，以75%乙醇固定，碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色20 min，流式细胞仪(FACSCalibur, BD, 美国)检测凋亡细胞。细胞凋亡率(apoptotic percentage,AP)计算公式如下：AP=凋亡细胞数/总检测细胞数×100%。

　　1.3 统计学处理 数据用±s表示, 以SPSS软件包进行正态性检验，显著性检验采用方差分析，两两比较采用SNK法，P<0.05有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 EPCs的鉴定 分离获得的单个核细胞初始为圆形或椭圆形，培养7天后形成以梭形为主的内皮样细胞。用DiI -acLDL和FITC-UEA-I染色后，通过共聚焦显微镜鉴定，UEA-I和DiI-acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs(图1)。

　　图1 通过共聚焦显微镜鉴定EPCs(UEA-I和Dil-acLDL双染色，×200)

　　A:EPCs摄取DiI-acLDL呈红色，其激发波长为543 nm;B:和UEA-I结合呈绿色，其激发波长为477 nm;C:双染色阳性细胞呈黄色

　　2.2 辛伐他汀增加外周血EPCs数量 结果显示：辛伐他汀显著增加EPCs数量，EPCs数量随着辛伐他汀浓度的增加而增加，在0.01 μmol/L达到最大效应，并且，0.01 μmol/L组和辛伐他汀其他各浓度组相比均有统计学意义(P<0.05)。而当继续增加辛伐他汀浓度时，EPCs的增殖活性反呈下降趋势(表1)。

　　2.3 辛伐他汀促进外周血EPCs黏附 辛伐他汀显著增加了贴壁细胞数，并且贴壁细胞数呈现随着辛伐他汀浓度的增加先增加，之后又逐步回到基线的趋势，在0.01 μmol/L时达到最大效应。 而1.0 μmol/L组和对照组相比无统计学差异(表1)。

　　2.4 辛伐他汀抑制外周血EPCs凋亡 流式细胞仪检查结果显示，辛伐他汀各浓度组都能够抑制外周血EPCs凋亡，并且0.01 μmol/L组作用最为明显，随着辛伐他汀浓度的增加抗凋亡作用先增强，之后又降低(表1)。 表1 不同浓度辛伐他汀对EPCs数量、黏附及凋亡功能的影响S0.0001～S1.0代表辛伐他汀各浓度组(μmol/L)，辛伐他汀对EPCs数量影响实验重复次数n=6，黏附n=6，凋亡n=3;与对照组比较：*P<0.05;与S0.01组比较：#P<0.05

　　3 讨 论

　　本研究发现，辛伐他汀能增加EPCs的数量、促进外周血EPCs黏附及抑制其凋亡。随着辛伐他汀剂量加大(0.0001、0.001、0.01 μmol/L )，EPCs数量增加、黏附功能及抗凋亡能力逐渐增强，辛伐他汀浓度在0.01 μmol/L时对EPCs功能影响达到最大，而当继续增大药物剂量(0.1、1.0 μmol/L)，EPCs的上述功能反而呈降低趋势。

　　HMGCoA还原酶抑制剂广泛运用于调脂治疗。此外，大规模实验已证实他汀能显著降低冠心病的死亡率和心血管事件的发生率[8] 。最近研究表明，他汀具有独立于调节血脂以外的作用，包括动员内皮祖细胞、提高内皮功能、抑制炎症等，从而具有缺血性心血管疾病的保护作用[9] 。

　　内皮祖细胞能够增加缺血组织新生血管形成，促进损伤内膜的再内皮化。内皮祖细胞的归巢包括外周血EPCs迁移到组织缺血或内皮损伤部位，黏附、结合到受损血管的过程[10]。本研究提示，他汀的临床益处可能部分归因于他汀能够增加EPCs数量、黏附能力和抑制其凋亡的作用。

　　本研究结果还表明，辛伐他汀增加EPCs数量、黏附功能和抗凋亡的效应随着药物浓度的增大先增强，之后又降低。这种现象与最近的一些研究是一致的[4,11]。此现象的具体原因目前尚不完全清楚，也许这跟药物的双相效应有关，过高浓度的他汀对细胞具有一定的毒副作用。

　　综上所述，辛伐他汀能够提高内皮祖细胞的数量、黏附能力并能抑制其凋亡。

　　【参考文献】

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　　[2] Dimmeler S, Aicher A, Vasa M, et al. HMG-CoA reductase inhibitors (statins) increase endothelial progenitor cells via the PI3-kinase/Akt pathway [J]. J Clin Invest, 2001,108(3):391-397.

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　　[6] Kalka C, Masuda H, Takahashi T, et al. Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(7):3422-3427.

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　　[8] Maron DJ, Fazio S, Linton MF. Current perspectives on statins [J]. Circulation,2000 ,101(2):207-213.

　　[9] Sacks FM, Pfeffer MA, Moye LA, et al. The effect of pravastatin on coronary events after myocardial infarction in patients with average cholesterol levels. Cholesterol and Recurrent Events Trial investigators [J]. N Engl J Med, 1996,335(14):1001-1009.

　　[10] Vajkoczy P, Blum S, Lamparter M, et al. Multistep nature of microvascular recruitment of ex vivo-expanded embryonic endothelial progenitor cells during tumor angiogenesis [J]. J Exp Med,2003, 197(12):1755-1765.

　　[11] 陈君柱， 张芙荣， 朱建华，等. 他汀类药物对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响[J] 中华心血管病杂志, 2004,32(4):346-350.