β3 .AR激动剂BRL35135、氯沙坦和二甲双胍对肥胖大鼠心肌UCP.2mRNA表达的影响

　　作者：张正生，冯毅，刘乃丰　(1.东南大学附属中大医院神经内科，江苏南京 210009;2.东南大学附属中大医院心脏科，江苏南京 210009)

　　Procalcitonin applied in early diagnosis of neonatal infection

　　ZHU Ling-ling，SHU Gui-hua，YAN Yu，XU Xiang

　　(Department of Neonate，Jiangsu Subai Hospital，Yangzhou225001，China)

　　Abstract:Objective To explore the early diagnosis method of neonatal infectious diseases and to investigate the clinical significance of procalcitonin(PCT)applied to neonatal infection.Methods Serum PCT，C-reaction protein(CRP)，blood routine and blood culture were measured in a total of76infectious neonates before antibiotics were administered.Their sensi-tivities and specificities for diagnosing bacterial infection were compared.Result (1)Serum PCT sensitivity and specificity for bacterial infection were81.36%(48.59)and64.7%(11.17)respectively.(2)CRP sensitivity and specificity for bacterial in-fection were47.46%(28.59)and70.59%(12.17)，with a significant difference(P<0.01)of sensitivity and no significant difference(P>0.05)in specificity compared to serum PCT.(3)Sensitivity and specificity for bacterial infection of WBC count and(or)abnormal classification were52.54%(31.59)and52.94%(9.17)，with a significant difference(P<0.05)compared with serum PCT.Conclusion As an early neonatal infection marker，serum PCT is superior to CRP and WBC count and classification.Dynamic monitoring the PCT level can be used to early diagnose and effectively treat neonatal infection，also it can be used to judge whether the infection is controlled.

　　Key words:procalcitonin;neonatal infection;early diagnosis

　　[摘要]目的: 探讨β3 .肾上腺素能受体激动剂BRL35135、氯沙坦和二甲双胍对肥胖大鼠心肌解偶联蛋白.2(UCP.2)mRNA表达及对胰岛素抵抗的影响。 方法: 以高脂饮食建立肥胖大鼠模型，分别予BRL35135(0.5mg?kg-1 ?d -1 )、氯沙坦(25mg?kg-1 ?d-1 )和二甲双胍(300mg?kg-1 ?d-1 )干预6周。取其心肌组织，采用RT.PCR法检测心肌组织中UCP.2mRNA的表达水平;测定药物干预后大鼠血糖、血脂及胰岛素水平。 结果: BRL35135和氯沙坦干预组UCP.2mRNA表达增加(P<0.001，P<0.005);二甲双胍干预组UCP.2mRNA表达轻度增加，但与对照组无显著性差异(P>0.05)。BRL35135和二甲双胍干预组血脂、血糖和胰岛素水平下降;氯沙坦干预组血糖和胰岛素水平降低，而血脂水平无明显变化。 结论: BRL35135和氯沙坦可以升高心肌中UCP.2mRNA的水平，延缓心肌肥厚进程。

　　[关键词] 解偶联蛋白.2;心肌肥厚;二甲双胍;BRL35135;氯沙坦;肥胖大鼠

　　解偶联蛋白(UCPs)是线粒体内膜上具有调节质子跨膜作用的特殊蛋白，可降低质子电化学梯度，使呼吸作用中电子传递过程和ATP的合成解偶联，将储存的能量以热能的形式释放，并提高静息代谢率。这部分散失的热量可占基础代谢率的20%～30%，它对人类的能量平衡与体温调节非常重要。目前已发现5种不同的UCPs家族成员，其中UCP.2广泛分布于人类及啮齿类动物各组织器官中，在心肌中含量尤为丰富。心肌细胞内能量代谢和提供高能磷酸键关系到心肌细胞内全部的生理功能，因此ATP的衰竭和缺失被认为是心肌病患者心力衰竭的重要原因。有研究发现，压力负荷所致的肥厚大鼠心肌中UCP.2mRNA水平比正常大鼠显著升高[1，2] 。本研究旨在探讨UCP.2mRNA在肥胖大鼠心肌中表达的变化，以及β3 .肾上腺素能受体(β3 .AR)激动剂BRL35135、氯沙坦和二甲双胍对UCP.2mRNA表达的影响，从而进一步探讨UCP.2在心肌肥厚发生中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　TRIzol Reagent RNA分离试剂(上海Sangon公司生产)，AMV逆转录酶、Taq DNA聚合酶(上海Promega公司生产)，BRL35135(美国SIGMA公司生产)，氯沙坦钾(科素亚，杭州默沙东制药有限公司生产)，二甲双胍(格华止，上海施贵宝制药有限公司生产)。

　　1.2 动物模型的建立

　　6周龄清洁级雄性SD大鼠90只(购自南京军区总医院实验动物中心)，平均体重(150±10)g，在20～22℃、12.12h光照.黑暗循环条件下自由进食饮水，适应性饲养5d，随机分为普通饮食组(n=10)和高脂饮食组(n=80)2组，分别喂食普通饲料和高脂饲料[3] 12周。高脂饮食组以大鼠体重大于普通饮食组平均体重20%为标准，筛选出47只达到肥胖标准的大鼠。其中5只肥胖大鼠(设为单纯高脂饮食组)与5只普通饮食组大鼠即刻处死速取心室肌约100mg，立即液氮速冻，-70℃保存备用，提取总RNA。其余组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液，浸蜡，包埋，切片(4μm)，HE染色。剩余42只肥胖大鼠随机分为4组:对照组(CON组，n=9)，生理盐水2ml灌胃;BRL35135组(β3 组，n=11，1周内死亡3只)，予BRL351350.5mg?kg-1 ?d-1 ;氯沙坦钾组(ARB组，n=11，1周内死亡2只)予氯沙坦钾25mg?kg-1 ?d-1 ;二甲双胍组(MET组，n=11，1周内死亡2只)，予二甲双胍组300mg?kg-1 ?d-1 。以上药物均溶于生理盐水2ml中灌胃，时间均为6周。之后禁食12h，经眶下静脉丛采血2ml，分离血清，-20℃保存备用，用于检测血糖、血脂及胰岛素。之后处死大鼠迅速取心室肌，处理方法同前。

　　1.3 RT.PCR法检测UCP.2mRNA的表达水平

　　用TRIzol按试剂盒操作步骤从100mg心室肌中提取总RNA。每个样本取总RNA2μg，用25μl反应体系逆转录合成cDNA;再以cDNA为模板进行扩增，反应总体积为50μl，其中10×Buffer5μl，MgCl2 3μl，dNTP1μl，UCP.2的上下游引物各1.6μl，GAPDH的上下游引物各0.4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，cDNA模板5μl，补双蒸水至总体积50μl。PCR反应步骤:首轮循环为94℃4min，后续循环为94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸40s，循环35次，末轮循环为72℃10min。PCR扩增产物经1.6%琼脂糖凝胶，电压5V?cm-1 ，时间60min。在相同的条件下进行PCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳后，应用凝胶成像分析系统对电泳结果成像并分析各电泳条带吸光度(A)，以GAPDH作为内参照，紫外灯下观察结果，以AUCP.2 .AGAPDH 表示。UCP.2的引物序列为:P1 ，5′.TAAAGCAGTTCTACACCAAGGG.3′;P2 ，5′.CGAAGGCAGAAGTGAAGTGG.3′。扩增片断长度为360bp。GAPDH的引物序列为:P3 ，5′.AATGCATC CTGCACCACCAACTGC.3′;P4 ，5′.GGAGGCCATGTAGGC CATGAGGTC.3′。扩增片断长度为555bp[4] 。

　　1.4 血糖、血脂及胰岛素的测定

　　用全自动生化分析仪(日本Hitach7250)测定血糖、血脂，放射免疫法测定胰岛素。其中胰岛素抵抗的评估采用胰岛素敏感性简易参数，稳态模式评估法(homeostasis model assessment，HOMA)中的HOMA.IR公式来评估胰岛素抵抗的程度，即HOMA.IR=[空腹胰岛素水平(μU?ml-1 )×空腹血糖水平(mmol?L-1 )]. 22.5。

　　1.5 统计学处理

　　所有数据以ˉx±s表示，采用SAS6.0统计软件，组间比较用方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 各试验组大鼠血清血脂、血糖、胰岛素及胰岛素抵抗水平MET组甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平均明显低于CON组，β

　　3 组的TG、CHO、HDL和LDL水平明显低于CON组，ARB组的TG、CHO、HDL和LDL水平与CON组相比无显著性差异，MET组、β3 组、ARB组的血糖、胰岛素、胰岛素抵抗程度均明显低于CON组，见表1。 表1 各试验组血脂、血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗程度比较(略)

　　2.2 常规石蜡病理切片结果

　　单纯高脂饮食组、CON组和MET组大鼠病理切片可见心肌细胞肿胀、体积变大，间隙变窄，细胞核增大、染色深，以左室内膜下为明显，为心肌肥厚的早期表现;而普通饮食组、β3 组和ARB组无上述改变。见图1～6。

　　2.3 RT.PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

　　各组均有360bp和555bp两条条带，与UCP.2和GAPDH的理论扩增片断长度相吻合。与CON组A值(为0.339±0.051)相比，ARB组A值(为0.614±0.063)、β3 组Q值(为0.705±0.060)均明显上升(P<0.005和P<0.001)，MET组A值(为0.381±0.044)无明显变化(P>0.05)，见图7。

　　3 讨 论

　　本研究发现高脂饮食的肥胖大鼠有早期心肌肥厚的表现，予β3 .AR激动剂BRL35135干预后，UCP.2表达较对照组明显增加，心肌肥厚明显减轻。药理学及分子克隆研究显示心脏存在β1 、β2 、β3 3种肾上腺素能受体[5] 。心室肌中只有β3 受体与Gi.o 蛋白相结合，刺激一氧化氮合酶(NOS，主要为eNOS)产生NO，使细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)增加[6] ，激活cGMP依赖的蛋白激酶，造成L型钙通道钙流下降或使肌丝蛋白变化造成收缩反应下降而降低心肌收缩力[7] ;另外cGMP激活磷酸二酯酶，降低cAMP水平。在心肌细胞中，NO通过β3 .AR产生负性变力作用，而cAMP通过β1 .AR、β2 .AR产生正性变力作用[8] ，正常情况下处于一个平衡状态。Kitamura等测定β3 .AR激动剂对豚鼠心功能及钙离子内流的影响时发现，当BRL37344的浓度在10-11 ～10-8 mol时，其负性肌力作用呈剂量依赖性，最大可降至对照组的80%，钙离子内流也降至对照组的92%[9] 。加用NOS抑制剂NG .硝基.L.精氨酸甲基酯后，减弱BRL37344负性肌力作用，提示β3 受体通过钙离子内流下降和激活NOS产生负性肌力作用。

　　在ARB组，心肌中UCP.2表达较对照组明显增加，无明显心肌肥厚的表现。血管紧张素Ⅱ除调节血压、钠水平衡外，还是一种生长因子，能促进心肌、平滑肌增长和间质纤维增生，导致心血管重构。氯沙坦是血管紧张素Ⅱ受体(AT1型)拮抗剂，可以阻断内源性及外源性的血管紧张素Ⅱ所产生的各种药理作用。

　　肥胖大鼠脂肪酸水平明显增高，为增加心肌细胞能量供应，脂肪酸代谢相应增加，产生大量活性氧簇(ROS)，ROS生成增加和二磷酸鸟苷(GDP)的减少可刺激UCP.2表达增加，导致心肌细胞ATP的生成障碍加重，形成恶性循环。线粒体是钙离子储存的一个重要场所，其内流或外流取决于线粒体膜电位。膜电位的下降是钙离子从线粒体外流的基础，膜电位的升高促进钙离子内流。因UCP.2可以调节线粒体的膜电位，所以对钙离子转运的调定点有很大影响。如果激活UCP.2，不仅可导致产热的解偶联，还可引起膜电位的下降，促使钙离子从线粒体中释放出来，限制线粒体内的钙超载，从而减少细胞的凋亡[10，11] 。钙离子浓度升高被认为是心肌细胞肥大的中心环节，其可影响心肌蛋白质合成，导致线粒体、细胞核损伤。文献报道[12] ，钙调神经磷酸酶受钙离子活化后，能使胞质中的T细胞核因子去磷酸化转位入核，调节心肌细胞肥大基因的表达，其实质还是增加蛋白质的合成。

　　在MET组，心肌中UCP.2表达较对照组无明显变化，光镜下观察与对照组也无明显差异，呈现早期心肌肥厚的表现;血清中的血脂、血糖，胰岛素水平与对照组相比显著下降，胰岛素敏感性升高。MET除了可以降低血糖外，还能抑制胃肠道对葡萄糖的吸收，减少脂肪组织体积使体重减轻;减少极低密度脂蛋白的合成，进而降低TG，抑制肠道羟甲基戊酸.CoA还原酶和乙酰.CoA胆固醇酰基转换酶活性，减少CHO的生成和储存，并减少CHO在动脉壁的堆积。

　　总之，UCP.2表达增加可引起心肌细胞ATP生成 障碍，导致心肌肥厚;但UCP.2表达增加也可抑制ROS的生成，限制细胞内钙超载，减少心肌细胞的凋亡。因此氯沙坦和BRL35135的作用可能是打破两种作用的平衡，增加UCP.2对心肌的保护作用，这为心肌肥厚的治疗提供了新的途径，但其具体的作用机制尚未明确。

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