血脂康预处理对心肌缺血再灌注大鼠炎症因子影响

　　作者：聂毛晓,张雪娟,滕蕾 作者单位：(青岛大学医学院附属医院心内科，山东 青岛 266003)

　　【摘要】 目的 观察血脂康预处理对急性心肌缺血再灌注损伤大鼠炎症因子的影响，探讨其可能的作用机制。方法 健康SD大鼠32只，随机分为空白组、假手术组、缺血再灌注组和血脂康预处理组，各8只。血脂康预处理组每天灌胃给予血脂康胶囊0.09 g/kg，其余各组给予等量生理盐水，连续7 d。缺血再灌注组和血脂康预处理组大鼠均开胸并结扎冠状动脉前降支30 min，然后再通60 min;假手术组只开胸不结扎冠状动脉，空白组不做任何处理。采集大鼠腹主动脉血，分离血清，检测白细胞介素(IL)1β、IL4、IL8、肿瘤坏死因子(TNFα)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、肌钙蛋白I (cTNI)含量，并处死动物取出心脏，计算心肌梗死面积。结果 缺血再灌注组IL1β、IL4、IL8、TNFα、CKMB和cTNI血清含量均明显高于空白组和假手术组(F=48.72～351.07,q=0.25～41.65,P<0.01);而血脂康预处理组上述指标除IL4外均低于缺血再灌注损伤组(q=0.35～32.65,P<0.05)，且血脂康预处理组大鼠心肌梗死面积小于缺血再灌注损伤组(F=231.26,q=17.21,P<0.05)。结论 血脂康能抑制促炎因子IL1β、IL8、TNFα的生成，并增加抗炎因子IL4生成，减轻心肌缺血再灌注损伤，对缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。

　　【关键词】 心肌;再灌注损伤;炎症;白细胞介素类;大鼠,SpragueDawley

　　EFFECT OF XUEZHIKANG PRETREATMENT ON INFLAMMATORY FACTOR OF MYOCARDIAL ISCHEMIAREPERFUSION INJURY IN RATS NIE MAOXIAO, ZHANG XUEJUAN, TENG LEI (Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To observe the effects of Xuezhikang capsules on inflammatory factor of myocardial ischemiareperfusion injury (MIRI) in rats and explore its possible mechanism of action. Methods Thirtytwo SD rats were evenly randomized to four groups: blank group, shamoperation group, MIRI group and Xuezhikang pretreatment group. The rats in Xuezhikang group were treated with Xuezhikang (0.09 g·kg-1·d-1, gastric gavage) and other groups were treated with the same amount of saline, for 7 days. Those in MIRI and Xuezhikang pretreatment groups underwent a thoracotomy and the left anterior descending branch of coronary artery was ligated for 30 minutes and then recanalized for 60 minutes; those in shamoperation group received only thoracotomy with no ligation of coronary artery; no any management was done for those in the blank group. Blood samples were extracted from the abdominal aorta, and the serum separated. The interleukin1β (IL1β), IL4, IL8, tumor necrosis factor alpha (TNFα), creatine kinaseMB (CKMB), and troponinI were detected. The area of myocardial infarction (MI) was calculated. Results In MIRI group, the serum levels of IL1β, IL4, IL8, TNFα, CKMB, and cTNI were significantly higher than those of normal group and shamoperation group (F=48.72-351.07，q=0.25-41.65，P<0.01), while the above parameters in the pretreatment group were lower than those of MIRI group, except IL4 (F=48.72-351,q=0.35-32.65,P<0.05). The area of MI in Xuezhikang pretreatment group was smaller than those in the MIRI (F=231.26，q=17.21，P<0.05). ConclusionXuezhikang can inhibit the production of proinflammatory factors, such as IL1β, IL8 and TNFα, and increase antiinflammatory IL4, thus lessening ischemiareperfusion inflammatory reaction and injury.

　　[KEY WORDS] myocardium; reperfusion injury; inflammation; interleukins; rats, SpragueDawley

　　在心血管疾病治疗过程中，许多新的治疗措施都不可避免地造成缺血再灌注损伤，因此缺血再灌注时的心肌保护越来越成为心血管领域的研究热点。心肌缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，氧自由基、钙超载、粒细胞浸润等都可能参与再灌注损伤的过程，对急性心肌梗死行早期心肌再灌注可挽救濒死心肌，但再灌注本身也会造成肌细胞损伤，即缺血再灌注损伤[1]。已有研究表明，急性心肌缺血再灌注损伤与炎症密切相关，炎症在心肌缺血再灌注损伤的发生和发展中起着重要的作用。血脂康是从特制的中药红曲中提炼而成，是我国自主开发研制的具有他汀类降脂作用的中药，富含羟甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂(洛伐他汀)、多种不饱和脂肪酸、人体必需氨基酸、甾醇和少量黄酮等多种有效成分，除具有降低血脂、防治动脉硬化功能外，还具有抑制巨噬细胞分泌、抗炎等作用。本文研究了血脂康对冠状动脉结扎及再通诱发的大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用，现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　健康成年SD大鼠32只，体质量200～250 g，随机分成空白组、假手术组、缺血再灌注组和血脂康预处理组，每组8只。所有动物均自由饮食，血脂康预处理组以血脂康0.09 g/kg溶于生理盐水灌胃，连续1周后行缺血再灌注术。其余各组给予等量生理盐水灌胃。

　　1.2 动物模型制备

　　按文献[23]方法，建立大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)模型。大鼠以100 g/L水合氯醛腹腔麻醉(4 mL/kg)，剪毛后切开颈部，分离气管，气管插管成功后连接小型动物呼吸机,连接压力换能器(BL420生物信号采集处理系统，成都泰盟科技有限工程公司生产)。于胸骨左缘切开皮肤，逐层分离，剪断第3肋骨，打开胸腔，剪破心包，暴露心脏，于冠状动脉前降支(LAD)根部穿线稳定10 min后，将一塑料凹槽与LAD并列，结扎，30 min后沿凹槽剪断结扎线，再灌注60 min后打开腹腔，于腹主动脉采血备用。缺血标志为T波增高(>0.2 mV)，再灌注的标志为T波下降。假手术组只开胸不结扎冠状动脉，空白组不做任何处理。

　　1.3 炎症因子检测方法

　　缺血再灌注组及血脂康预处理组大鼠均于再灌注60 min后,腹主动脉取血，以3 000 r/min离心15 min，分离血清-20 ℃保存，采用酶联免疫吸附法测定肌钙蛋白I(cTNI)、肌酸激酶同工酶(CKMB)(试剂盒均购自南京建成生物工程研究所)和白细胞介素(IL)β、IL4、IL8、肿瘤坏死因子(TNFα)水平(试剂盒为美国R&D公司产品)，严格按试剂盒说明书进行操作。

　　1.4 心电图ST段测定

　　选择ST段抬高明显的Ⅱ导联记录心电图。

　　1.5 心肌梗死面积检测

　　实验结束前结扎左冠状动脉，0.1 g/L伊文蓝注入左心室内，取出心脏，用缓冲液冲洗，冷冻后将其横断面切成1 mm的切片，用0.25 mmol/L四唑氮蓝(NBT)染色10 min。测定伊文蓝未染色区心肌组织质量，代表心肌缺血危险区质量;同时测定NBT区心肌组织质量，代表梗死区质量。以梗死区心肌与心肌缺血危险区心肌质量的百分比表示心肌梗死范围。

　　1.6 统计学处理

　　应用SPSS 16及PPMS 1.5[4]统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，两组间比较用t检验,多组间比较使用方差分析，以P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 各组心电图变化

　　空白组与假手术组心电图无明显改变，缺血再灌注组与血脂康预处理组前降支结扎前后ST段抬高及T波改变显著。于Ⅱ导联选择5次心搏动计算ST段抬高毫伏平均数,缺血再灌注组ST段较空白组及假手术组明显抬高(q=0.25～12.31,P<0.01)，而血脂康预处理组ST段较缺血再灌注组降低(q=9.01,P<0.05)。见表1。

　　2.2 各组心肌梗死面积比较

　　缺血再灌注组及血脂康预处理组的心肌梗死面积均显著大于空白组及假手术组(F=231.26，q=1.09～20.11,P<0.01);而血脂康预处理组心肌梗死面积小于缺血再灌注组(F=231.26,q=17.21,P<0.05)。见表1。镜下见缺血再灌注组细胞病变较重，心肌纤维失去正常形态;而血脂康预处理组心肌纤维排列较整齐,有轻度肿胀,核形状较规则,病变减轻,表明血脂康能减轻缺血再灌注心肌损伤。

　　2.3 各组心肌酶检测结果比较

　　与空白组及假手术组比较，缺血再灌注组大鼠CKMB和cTNI含量明显升高，差异有显著性(F=97.28～153.04,q=1.49～31.40,P<0.01);而血脂康预处理组上述指标均较缺血再灌注组下降，两组相比差异有统计学意义(q=2.34～28.31,P<0.05)。见表1。

　　2.4 各组炎症因子检测结果比较

　　缺血再灌注组血清IL1β、IL8、cTNI、TNFα均高于空白组与假手术组(F=55.92～351.07,q=1.77～41.65,P<0.01);与缺血再灌注组比，血脂康预处理组上述炎症因子水平下降，差异有统计学意义(F=55.92～351.07,q=13.11～29.17,P<0.01);血脂康预处理组IL4的水平明显高于其他3　组(F=197.89,q=25.26,P<0.05)。见表2。表1 各组心肌梗死面积、心电图ST段抬高及心肌酶检测结果(n=8,±s)组 别心肌梗死面积　表2 各组血清IL1β、IL4、TNFα、IL8水平的检测结果

　　3 讨 论

　　心肌缺血再灌注损伤是常见的复杂的病理生理过程，其机制与氧自由基、炎细胞激活等因素有关。研究显示，心肌缺血再灌注时伴随血浆炎性细胞因子及抗炎细胞因子的升高(其增高程度和心肌微循环的损伤程度有关)，心肌组织水平灌注不良越严重，细胞因子升高越明显;且抗炎细胞因子的升幅远低于炎性细胞因子[5]。IL1β是一种来源广泛的多功能的细胞因子，参与多种炎症反应，促进组织损伤。SIMON等[6]的研究结果证明，不稳定型心绞痛病人ILlβ浓度显著高于稳定型心绞痛及无症状病人。正常情况下，IL1β在血液中含量很低，而在生物、理化因素的诱导下，单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞等均能表达及释放IL1β。大量研究表明，中性粒细胞浸润在心肌缺血再灌注损伤的病理发展中扮演重要角色。中性粒细胞在缺血再灌注过程中聚集于心肌，通过一系列机制造成组织细胞的损伤和功能的丧失，IL1β能刺激血管内皮细胞表达细胞间黏附分子1，促进中性粒细胞和内皮细胞的黏附，诱导中性粒细胞黏附在内皮细胞和内皮下基质并穿过内皮细胞迁入缺血区，通过阻塞微血管、释放氧自由基等机制导致心肌细胞损伤。本实验缺血再灌注组IL1β水平较空白组及假手术组显著升高，进一步证实了IL1β在急性心肌缺血损伤中的作用;而血脂康预处理组IL1β水平较缺血再灌注组明显下降，证明了血脂康能降低IL1β水平，抑制心肌急性缺血再灌注时的炎症反应，起到对心肌缺血再灌注的保护作用。

　　TNFα是缺血再灌注损伤连锁反应中的关键性递质，能诱导白细胞聚集和释放IL6、IL8、血小板活化因子、白三烯等炎症递质，诱发缺血再灌注损伤。IL8是一种重要的促炎因子，心肌缺血再灌注后IL8升高并持续较长时间，血清IL8浓度可反映心肌损伤。本研究结果显示，缺血再灌注损伤时，TNFα、IL8均显著升高;而血脂康预处理后，TNFα、IL8均显著降低。提示血脂康通过抑制TNFα、IL8释放，从而减轻炎症反应，发挥对缺血再灌注心肌的保护作用。

　　IL4被普遍认为是抗炎细胞因子,是由Th2细胞分泌的细胞因子，是B淋巴细胞生长和分化因子。它可抑制Thl细胞分泌IL6、TNFa等促炎因子，研究结果表明Th2细胞有重要的抗炎作用，而且Th2也可通过负调节机制抑制Thl细胞介导的免疫反应而发挥抗炎作用。贾兴旺等[7]研究显示，冠心病病人血浆中IL4含量低于正常组，且急性心肌梗死病人IL4显著低于正常人。本研究结果显示，缺血再灌注组血清IL4水平低于空白组和假手术组，提示机体冠状动脉炎症及其防御性反应失平衡。血脂康预处理组IL4较其他3组明显升高，证明血脂康预处理可增高血清IL4含量，进而通过抑制细胞因子、趋化因子等炎症递质的产生而发挥对心肌缺血再灌注的保护作用。

　　缺血再灌注时剧增的氧自由基加重细胞膜的损伤，细胞内CKMB、cTNI释放入血，引起相应酶在血液中浓度升高，这些酶释放入血的多少与心肌坏死程度呈正相关[8]，故测定其血清含量被认为有助于心肌缺血损伤程度的诊断。本研究显示，缺血再灌注损伤时，CKMB、cTNI均显著升高，心肌梗死面积显著增大，表明缺血再灌注后心肌不可逆损伤加剧，以致坏死溶解的心肌释放CKMB、cTNI明显增多;而血脂康预处理后,CKMB、cTNT均显著降低，说明血脂康可减轻心肌细胞膜的损伤，降低心肌酶的释放。其机制可能是通过抑制炎症反应、减少氧自由基的生成，从而减轻心肌细胞损伤。

　　综上所述，血脂康可能通过抑制促炎因子的生成，同时增加血清抗炎因子含量，从而抑制PMNs的迁移、浸润和激活，减轻缺血再灌注时炎症反应，进而减少心肌缺血再灌注的心肌损伤，发挥对缺血再灌注的保护作用，提示血脂康可用于缺血性心血管疾病的治疗。

　　【参考文献】

　　[1]刘付平,姚宏伟,李俊. 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的改进[J]. 安徽医科大学学报, 2003,38(3):234236.

　　[2]高治平,胡弼. 现代实用医学机能实验技术与方法[M]. 长沙：湖南科学技术出版社, 2003：5657.

　　[3]李国营,田素民,于连发,等. 兔心肌缺血及缺血再灌注模型的制备[J]. 解剖学研究, 2002,24(3)：237238.

　　[4]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.

　　[5]李巧汶,邱健. 炎症标记物与冠心病关系的研究进展[J]. 心脏杂志, 2008,20(3)：359362.

　　[6]SIMON A D, YAZDANI S, WANG W, et al. Circulating levels of ILl beta a prothrombotic cytokine are elevated in unstable angina versus stable angina[J]. J Thromb Thrombolysis, 2000,9：217222.

　　[7]贾兴旺,田亚平,郭广宏,等. 血清12项细胞因子在冠心病诊断中的应用价值[J]. 中华检验医学杂志, 2006,9:2931.

　　[8]KRANTZ D S, QUIGLEY J F, OCALLAHAN M. Mental stress as a trigger of acutecardiac events：the role of laboratory studies[J]. Ital Heart J, 2001,2(12)：895899.