交界区逸搏节律的细胞及电生理学基础

　　作者：任付先，牛小麟，韩振华，欧妍，凌凤东 作者单位：1. 西安交通大学医学院第二附属医院心内科，陕西西安 710061;2. 河南省濮阳市油田总医院心内科，河南濮阳 457001;3. 西安交通大学医学院第二附属医院肾内科，陕西西安 710061; 4. 西安交通大学医学院人体解剖学与组织胚胎学系，陕西西安 710004

　　【摘要】 目的 探讨交界区逸搏节律的细胞及电生理学基础。方法 组织切片Masson染色;酶解分离单个心肌细胞;单细胞膜片钳技术研究具有自律特性细胞的动作电位特征。结果 组织学研究发现家兔致密结及房室结后延伸细胞组成具有异质性且呈规律性排列;单细胞形态学观察可见不同于普通心房肌细胞的起搏细胞(PC)、过渡细胞α(TCα)和β，且PC和TCα呈现自发规律性收缩。三种细胞相比较，在动作电位波形、最大舒张电位、0期除极速度、动作电位复极至90%时程(APD90)、舒张期自动除极速率(VDD)、动作电位超射值及幅值方面，PC和TCα之间除APD90和VDD外，其他各指标差异无统计学意义(P>0.05)。TCβ与PC、TCα分别相比，各项指标差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 家兔致密结及房室结后延伸具有自律特性的PC及TCα可能是交界区逸搏节律的细胞学基础。

　　【关键词】 交界区逸搏;形态学;动作电位;膜片钳;起搏细胞

　　cardiac junctional escape rhythmREN Fuxian1,2, NIU Xiaolin1, HAN Zhenhua1, OU Yan1,3, LING Fengdong4

　　(1. Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Cardiology,

　　General Hospital of Puyang Oil Field, Puyang 457001; 3. Department of Nephrology,

　　the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;

　　4. Department of Anatomy and Histology & Embryology, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To explore the cytological and electrophysiological basis of junctional rhythm. Methods Histological sections were stained by Masson method to observe the arrangement of cardiac cells in junctional area of rabbit heart; single viable cells were isolated enzymatically for morphological research; wholecell patch clamp was employed to study the action potential properties of specialized cardiac cells. Results Histologically, the cellular components in compact AV node and PNE were heterogeneous; the cells were organized regularly. Cytologically, the specialized cells PC, TCα and β were presented with the former two types automatically contracted. Electrophysiologically, the action potential configuration, maximum depolarization potential, action potential duration to 90% repolarization, velocity of depolarization in phase 0, velocity of phase 4 depolarization, overshoot and amplitude of action potential between PC and TCα were not significantly different except for action potential duration to 90% repolarization and velocity of phase 4 depolarization (all P>0.05); conversely, the above parameters between TCβ and PC, TCα respectively were significantly different (all P<0.05). Conclusion The specialized PC and TCα which demonstrated automaticity might construct the leading pacemaking focus in junctional escape rhythm.

　　KEY WORDS: junctional escape rhythm; morphology; action potential; patch clamp; pacemaker cell

　　在窦房结功能障碍、不能有效发放冲动或者高度窦房阻滞的情况下，房室结自律性增高，发放冲动控制心脏的机械活动，以保证全身组织器官的有效血液供应。有关房室交界区异位起搏点的位置和细胞成份尚存在很大分歧。一般认为，房室交界性节律点位于致密结和结希区[12];DOBRZYNSKI[3]及LI[4]等发现，多数情况下，交界性节律的优势起搏点位于房室结后延伸。但有关该部位的细胞成份及其电生理特征未见全面描述。本文从组织及单细胞形态学角度研究了房室结后延伸(posterior nodal extension, PNE)及致密房室结(compact AV node, CN)心肌细胞的组成，并采用单细胞膜片钳技术探讨了具有自律特性的心肌细胞的电生理特征，为理解交界区逸搏节律的形成和维持机制提供依据。

　　1 材料与方法

　　体重1.5～2.0kg、月龄4～6个月的健康成年家兔15只，雌雄不拘。5只用于组织学研究，另10只用于单细胞形态及电生理学研究。以上动物由西安交通大学医学院实验动物中心提供，所有实验程序均符合西安交通大学实验动物管理及使用规定。

　　1.1 组织切片制作 经耳缘静脉注入空气5～10mL致家兔死亡，于肋弓部做倒“V”字形切口，迅速打开胸腔暴露心脏，小心剪开心包，游离心底部及双侧肺动、静脉，迅速剪断，取出完整心脏，剪去心尖大部，稍加冲洗后投入100mL/L甲醛溶液(3.33mol/L)固定72h。然后取出，切取PNE区心肌组织块，常规脱水、石蜡包埋，制作心肌组织切片。沿与Koch三角平行的矢状切面连续切片，每2片保留1片，片厚6μm。将制做好的组织切片进行Masson染色，以备组织学观察。光学显微镜下观察房室交界区(包括致密结及PNE)心肌组织的形态特征，Olympus自动显微照相系统采集相应部位心肌细胞的不同放大倍数图像供分析。

　　1.2 单细胞分离及识别 按本课题组已发表的研究方法[5]分离、保存及鉴定家兔心肌细胞，实验过程中分别采用普通光学显微镜及相差显微镜观察心肌细胞，并拍照以备形态学比较研究。

　　1.3 电生理学实验 从各实验动物心肌细胞悬液中分别选定3个不同类型的心肌细胞用于电生理研究。改良HAMILL法[6]建立全细胞记录模式，恒温恒速灌流液中记录各种待测细胞的动作电位，采用pClamp软件包分析、测量并记录各种心肌细胞的相应参数供比较研究。

　　1.4 统计学分析及图片处理 实验动物心肌单细胞光镜下测值及单细胞电生理学参数以±s表示，应用SPSS 11.0软件包对相关数据进行统计学分析。两均数之间的比较采用t检验;多组数据均数比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，P<0.05为差异具有统计学意义。所用图片采用Photoshop 8.0处理。

　　2 结 果

　　2.1 组织学特征 家兔PNE心肌组织Masson染色矢状切片低倍镜下可见CN由细薄疏松波浪状排列的浅层、细胞交织致密排列的中层以及交叉排列形成的深层组成(图1A)。致密结至冠状窦口可见2～4条相对集中的淡染的细胞条带规律性分布, 与本课题组前期研究[68]结果相吻合。本文只关注致密结及PNE部的心肌细胞成分。

　　高倍镜下致密结及PNE部可见到三类形态不同的特化心肌细胞(图1B、1C)：第一类细胞染色最浅，形状短而不规则，胞膜边界不清，肌原纤维少，核大呈圆形，核周空旷，染色质细腻，此种细胞数量较少，散在分布于整个Koch三角区，以致密结部分较多见，属于起搏细胞(pacing cell, PC);第二类染色较浅，细胞内肌原纤维的数量较少，分布较乱，细胞呈梭状，胞核椭圆形或梭形，闰盘结构稀疏，为过渡细胞α(transitional cell α, TCα);第三类细胞染色较深，长径较长，胞内肌原纤维的数量较多，分布较规律，闰盘结构亦较多，核呈圆形或椭圆，为过渡细胞β(transitional cell β, TCβ)。三类特化心肌细胞具有潜在的起搏功能，在交界性逸搏心律的形成和维持中发挥作用。参照本课题组已发表的研究结果将交界区组织切片中的PC、TCα及TCβ的组织学特征列于表1。表1 家兔心脏AVN及房室结后延伸组织切片上PC和TC的组织学特征

　　2.2 单细胞形态特征 单细胞形态学上(图 2)，PC胞体呈不规则的蜘蛛样，胞核呈圆形不甚明显，位于中央，横纹稀疏，细胞膜表面多个分叉，排列无规则，并呈自发规律性搏动，频率约为(54.37±2.63)b/min。TCα胞体较小呈梭状，有时可见两端弯曲;胞核居中呈椭圆形;横纹模糊且稀疏，排列不规则;自发搏动频率约为(24.70±1.28)b/min。TCβ外形与TCα 较相似，胞核亦呈椭圆形，基本位于胞体中部，横纹较明显且排列规则，但长径相对较长，有时可见分叉，搏动频率约为(16.96±1.88)b/min。兹将三种细胞相差显微图像附于图2，相应的形态学特点列于表2以便比较。

　　2.3 动作电位部分 本实验中，光镜下可见PC、TCα两类心肌细胞呈自发规律性搏动。图3为从PC、TCα及TCβ三种心肌细胞记录到的动作电位原始曲线。电流钳制模式下，在未给预设刺激的情况下从PC记录到自发动作电位图形(图3)。其0相呈斜坡样，表明除极速率较慢，超射值较低，无平台期，并有显著的舒张期自动去极化。这种在未施加外来刺激情况下出现的自发电活动持续时间长，伴随有细胞规律性低幅搏动，停止电流钳制亦不自动终止。

　　电流钳制模式下，预设刺激脉冲可诱发TCα出现自发动作电位波形(图3)。TCα动作电位原始曲线显示，首个动作电位波形为刺激程式所诱发，随后出现的动作电位波形前无刺激脉冲发放。与PC相比，其0相亦呈斜坡样，超射幅度稍高于前者，亦无明显平台期，舒张期(4期)自动除极的幅度和速率均较低，其搏动频率较慢、幅度较大，停止电流钳制模式后仍持续搏动，并伴有相应的动作电位波形。

　　预设刺激程式可诱发TCβ出现动作电位波形。如图3所示，其0相陡峭，超射幅度较高，平台期明显，在外加刺激诱发的动作电位复极末期出现膜电位超极化现象，随后基线呈斜坡样缓慢上升，相隔3200ms后出现一“丘状”波形。延长记录时间无法记录到自发“丘状”波形，重复刺激时“丘状”波形可重复出现。

　　兹将PC、TCα、TCβ动作电位之最大舒张电位(maximum depolarization potential, MDP)、0期除极速度(velocity of phase 0 depolarization, Vmax)、动作电位复极至90%时程(action potential duration of 90% repolarization, APD90)、舒张期(4期)自动除极速率(velocity of phase 4 depolarization, VDD)、动作电位超射值(velocity of overshoot, Voversh)及动作电位幅值(action potential amplitude, APA)分别列于表3进行比较。三类细胞相比，PC和TCα之间除APD90和VDD外，其他各指标差别无统计学意义(P均>0.05)。TCβ与PC、TCα相比，各项指标的差别有统计学意义(P均<0.05)。表3 家兔AVN及PNE区单个心肌细胞的动作电位参数

　　3 讨 论

　　房室交界区心肌组织不但是生理情况下冲动传导的必经之路，也是交界区异位节律的发源地。多项针对房室交界区的组织学研究均证明，其细胞组成及排列存在异质性。但在交界区逸搏节律形成中起关键作用的细胞成分尚存在争议。本实验首先对房室交界区心肌进行了组织学观察，并利用双酶解法急性分离获取成年家兔单个心肌细胞进行形态学研究，最后采用单细胞膜片钳技术研究了上述三种心肌细胞的动作电位特征。其结果对理解交界性逸搏节律的形成和维持机制具有重要意义。

　　3.1 房室交界区心肌组织的细胞组成及排列异质性 本实验结果表明，家兔房室交界区心肌组织由多种细胞成分混合排列构成，该观察结果与文献报道和本课题组的前期工作基本吻合[79]。组织学上，外形圆或椭圆、胞核大而圆且只有极少量肌原纤维的起搏细胞[10]不但存在于致密结内，在PNE也大量存在。过渡细胞是交界区主要的细胞成分，其形状、染色、肌原纤维数量及分布介于普通心房肌细胞(atrial cell, AC)和PC之间，具有渐变特征，同时在Koch三角区集中分布，在冠状窦和致密结之间呈多条由特化的TC规律排列组成的细胞条带[912]。这种特征性细胞组成及分布在国内外学者[1315]对家猪、犬、家兔、豚鼠等多种动物的研究中得到了证实，可能具有重要的生理及病理生理学意义。

　　3.2 房室交界区单个心肌细胞的组成及特征 本实验采用改良Hancox法酶解分离家兔房室交界区心肌组织，结果发现存在PC、TCα与TCβ三种特化的心肌细胞，与组织学观察结果相符合。单细胞形态学观察研究时发现，外形酷似蜘蛛样的PC及细小梭形的TCα在正常Tyrode液中均存在自发搏动，其形状与ANDERSON[8]描述的存在于致密结的过渡细胞和结下细胞非常相似。该结果与既往组织学研究中Koch三角区细胞多样性的结论相符，蜘蛛样细胞作为一种独立的细胞类型存在于房室交界区;与同样具有自发搏动的TCα可能构成交界区异位搏动节律的细胞学基础。

　　3.3 房室交界区心肌细胞的动作电位特征及意义 长期以来, 人们对房室交界区心肌细胞的电生理活动规律进行了不懈的探索，所获结果对理解交界区逸搏心律的形成及维持提供了极其重要的证据。1960年PAES DE CARVALHO等[1]在房间隔、室间隔、下腔静脉和三尖瓣围成的区域内记录到三种不同的动作电位。ANDERSON于1974年[8]在一项针对家兔房室结标本进行的形态结合电生理学研究中亦记录到相似的结果，并指出可能分别来自于AN、N和NH细胞的电活动。BILLETTE及其研究小组[15]采用心房周期性期前刺激研究心脏冲动在房室结的传导时，记录到AN、ANCO、ANL、N、NH和H样动作电位波形, 并认为这些不同的动作电位波形是由相应部位心内膜下心肌细胞的电活动所产生。

　　2003年DOBRZYNSKI等[3]对家兔交界区节律的起源及分子基础进行了卓有成效的研究。结果发现，去除窦房结后，包括整个房室交界区的心肌组织出现交界性节律;免疫组织化学研究发现，起搏活动由表达If通道蛋白HCN4和连接蛋白NF160、Cx45 以及少量Cx40的结样细胞发出;结性节律的优势起搏点位于冠状窦与三尖瓣之间的PNE区。而以往大多数研究认为优势起搏点位于致密结或结希区。本课题组在对家兔房室结标本进行的离体灌注电生理实验中[12]，在房室结后延伸部记录到了类似于AN细胞的自发慢反应电位。

　　本研究组织学部分结果提示，在PNE及CN均存在较大量的PC及TC。在定位取材的基础上酶解分离AVN及PNE心肌细胞，并在电流钳制模式下记录到特化的PC、TCα与TCβ具有舒张期(4期)缓慢自动除极的不同形态和时程特点的动作电位波形，该结果与在完整房室结标本[11,16]上记录到的动作电位波形和其他学者报道的急性分离的房室结细胞动作电位波形相似[1718];在MDP、APA、Vmax及VDD和动作电位波形方面，分别具有类似于N型、NH型和AN型动作电位特点，与STRAUSS等[19]和HARU等[20]在家兔窦房结周细胞和SAN固有细胞上记录到自发性动作电位相同。

　　PC在没有外来刺激的情况下可连续出现自发动作电位;TCα及TCβ在单细胞形态学上与来自于同部位的PC差别明显，但均存在舒张期(4期)缓慢自动除极，可能是交界区节律形成的细胞学基础。事实上，单脉冲刺激TCα可诱发出连续的动作电位波形产生， TCβ只出现不可传播的低幅动作电位。因此，推测PC和TCα构成了交界区节律的细胞学基础， PC为交界区节律的优势起搏细胞;而TCβ可能在其他类型室上性心律失常的形成及维持机制中发挥作用。

　　【参考文献】

　　[1]PAES DE CARVALHO A, DE MELLO WC, HOFFMAN BF, et al. The specialized tissues of the heart [C]. Amsterdam, the Netherlands: Elsevier, 1961.

　　[2]WATANABE Y, DREIFUS LS. Sites of impulse formation within the atrioventricular junction of the rabbit [J]. Circ Res, 1968, 22:717727.

　　[3]DOBRZYNSKI H, NIKOLSKI VP, ALEXANDRE T, et al. Site of origin and molecular substrate of atrioventricular junctional rhythm in the rabbit heart [J]. Circ Res, 2003, 93:11021110.

　　[4]LI J, GREENER ID, INADA S, et al. Computer threedimensional reconstruction of the atrioventricular node [J]. Circ Res. 2008, 102(8):975985.

　　[5]REN FX, NIU XL, OU Y, et al. Morphological and electrophysiological properties of single myocardial cells from Koch triangle of rabbit heart [J]. Chin Med J, 2006, 119(24):20752084.

　　[6]HAMILL OP, NEHER ME, SAKMANN B, et al. Improved patchclamp technique for high resolution current recording from cells and cell free membrane patches [J]. Pflugers Archiv, 1981, 391:85100.

　　[7]杜庆暄，牛小麟，谢松梅，等. 兔心房室隔内过渡细胞移行带计算机辅助三维重建 [J]. 中华心律失常学杂志, 2005, 9(1):4446.

　　[8]ANDERSON RH, DURRER D, JANSE MJ, et al. A combined morphological and electrophysiological study of the atrioventricular node of the rabbit heart [J]. Circ Res, 1974, 35(6):909922.

　　[9]凌凤东，赵根然，林奇. 人心房室隔内正常或异常兴奋传导的解剖学基础 [J]. 解剖科学进展, 1997, 3(4):316320.

　　[10]SHERF L, JANE TN, WOODS WT. Function of the atrioventricular nodal considered on the basis of observed histology and fine structure [J]. J Am Coll Cardiol, 1985, 5(4):770.

　　[11]JAMES TN. The connecting pathways between the sinus node and AV node and between the right and the left atrium in human heart [J]. Am Heart J, 1963, 66:498.

　　[12]XIE SM, NIU XL, DONG ED, et al. Morphological and electrophysiological on the inferior nodal extension and transitional cellular band in the rabbit atrioventricular junctional area [J]. Chin Med J, 2004, 117(4):532537.

　　[13]HANCOX JC, LEVI AJ, LEE CO. A method for isolating rabbit atrioventricular node myocytes which retain normal morphology and function [J]. Am J Physiol, 1993, 265 (Heart Circ. Physiol 34):H755H766.

　　[14]谌辉，黄从新. 家兔房室交界区及其周围组织立体结构的形态学研究 [J]. 中国心脏起搏与心电生理杂志, 2004, 8(4):297301.

　　[15]BILLETTE J, JANSE MJ, VAN CAPELLE FJ, et al. Cyclelength dependent properties of AV nodal activation in rabbit hearts [J]. Am J Physiol, 1976, 231:11291139.

　　[16]MCGUIRE MA, DE BAKKER JMT, VERMEULEN JT, et al. Origin and significance of double potentials near the atrioventricular node: correlation of extracellular potentials, intracellular potentials and histology [J]. Circulation, 1994, 89:23512360.

　　[17]TANIGUCHI J, KOKUBUN S, NOMA A, et al. Spontaneously active cells isolated from the sinoatrial and atrioventricular nodes of the rabbit heart [J]. Jpn J Physiol, 1981, 31:547558.

　　[18]MUNK AA, ADJEMIAN RA, ZHAO J, et al. A Electrophysiological properties of morphologically distinct cells isolated from the rabbit atrioventricular node [J]. J Physiol, 1996, 493(3):801818.

　　[19]ANTONIO PDC, DARCY FDA. Spread of activity through the atrioventricular node [J]. Circ. Res, 1960, 8:801809.

　　[20]STRAUSS HC , BIGGER TJ. Elactrophysiological properties of the rabbit sinoatrial peronodal fibers [J]. Circ Res, 1972, 31:490506.