不同β受体阻滞剂抗家兔动脉粥样硬化作用的研究

　　作者：丁思华 作者单位：青岛大学医学院附属医院心内科，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 探讨卡维地洛和不同剂量美托洛尔的抗动脉粥样硬化作用及其机制，并对二者的疗效作一对比。方法 雄性新西兰大耳白兔40只，随机分为正常组、高脂组、小剂量美托洛尔组、大剂量美托洛尔组、卡维地洛组，每组8只，分别按不同方法喂养10周。实验结束后，分别检测各组家兔血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量。采用免疫组化的方法分别测定各组血管壁增殖细胞核抗原(PCNA)及核因子kBp65(NFkBp65)的表达。结果 与正常组比较，高脂组血清SOD活性降低，MDA含量增加，差异有显著性(F=8.40、41.22,q=3.81、11.27,P<0.05);高脂组，小、大剂量美托洛尔组血清SOD活性和MDA含量比较差异无统计学意义(q=0.28～0.41,P>0.05);与高脂组及小、大剂量美托洛尔组比较，卡维地洛组血清SOD活性明显升高，血清MDA含量明显下降(q=1.13～9.45,P<0.05)。高脂组血管壁PCNA和NFkBp65的表达较正常组明显增加(F=138.46、78.67,q=54.32、32.59,P<0.05);高脂组及小、大剂量美托洛尔组、卡维地洛组血管壁PCNA和NFkBp65的表达依次减少，差异有显著性(q=28.89～78.41,P<0.05)。相关分析表明，各组PCNA和NFkBp65水平呈正相关(r=0.975，P<0.01)。结论 美托洛尔与卡维地洛均具有抗动脉粥样硬化的作用，美托洛尔抗动脉粥样硬化的作用呈剂量依赖性;卡维地洛抗动脉粥样硬化的效应优于美托洛尔，其原因可能是卡维地洛具有较强的抗氧化作用。

　　【关键词】 动脉硬化 美托洛尔 卡维地洛 超氧化物歧化酶 丙二醛

　　EXPERIMENTAL STUDY OF THE EFFECT OF METOPROLOL AND CARVEDILOL AGAINST ARTEROSCLEROSISDING SIHUA, TIAN JIANHUI, ZHAO MEI, et al (Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College， Qingdao 266003, China) [ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the mechanism of carvedilol and metoprolol in different doses against arterosclerosis and compare their therapeutic effect. MethodsMale New Zealand white rabbits (n=40) were randomly and evenly divided into five groups: normal group, highfatdiet group, lowdosemetoprolol group, highdosemetoprolol group and cavedilol group. Ten weeks later, levels of serum superoxide dismutase (SOD) and malondiadehede (MDA) were measured. Expression of PCNA and NFkBp65 in aorta was detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with the normal group, lower level of serum SOD and higher level of serum MDA were found in the highfatdiet group (F=8.40,41.22;q=3.81,11.27;P<0.05). No statistical differences were observed among the levels of serum SOD and MDA between the highfatdiet group and metoprolol group either in low or high dose (q=0.28-0.41, P>0.05), but higher levels of serum SOD and lower levels of serum MDA were found in carvedilol group, compared with the other four groups (q=1.13-9.45, P<0.05). Expression of PCNA and NFkBp65 in the aorta of the highfatdiet animals was obviously stronger than those of the normal group (F=138.46,78.67;q=54.32,32.59; P<0.05). There existed a decreasing gradient in the expression of PCNA and NFkBp65 among the animals of high fat diet, lowdose metoprolol, highdose metoprolol and cavedilol group (q=28.89-78.41, P<0.05). A positive correlation was found in the expression of PCNA and NFkBp65 among the five groups (r=0.975, P<0.01). ConclusionBoth metoprolol and cavedilol posses antiarteroscleotic effect and metoprolol is of dosedependent. Carvedilol is better than metoprolol due to its stronger antioxidative effect.

　　[KEY WORDS]arteriosclerosis; metoprolol; carvedilol; superoxide dismutase; malondiadehede

　　动脉粥样硬化(AS)是许多心脑血管疾病的基础性病理表现,也是中老年人常见疾病之一，严重威胁着人类的健康。氧化损伤是AS病变过程中核心环节，而平滑肌细胞的迁移增殖是斑块形成、管腔狭窄的直接原因。β受体阻滞剂抗AS作用近年来逐步受到重视[1]。国外BCAPS和ELVA两项研究初步揭示了β受体阻滞剂具有不依赖于其降血压作用的抗AS效应，但其作用机制尚待进一步研究[2]。本实验经高脂饮食加免疫损伤血管内皮制备家兔动脉粥样硬化模型，通过给予卡维地洛和不同剂量美托洛尔，观察其对AS病变过程中脂质过氧化损伤、血管壁增殖细胞核抗原(PCNA)以及核因子kBp65(NFkBp65)活化的影响，进一步阐述其抗AS作用机制，并对二者的疗效进行对比，从而为临床治疗AS病人提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物

　　美托洛尔由阿斯利康制药有限公司提供，批准文号：国药准字H32025390;卡维地洛由齐鲁制药有限公司提供，批准文号：国药准字H20000100。

　　1.2 主要试剂

　　PCNA和NFkBp65及相关SP试剂盒购自武汉博士德生物工程研究所。

　　1.3 主要仪器

　　上海精密仪器厂721型分光光度计，美国Lambert公司石蜡切片机，日本Olympus公司显微照相装置，德国欧波同公司VIDAS 21图像分析系统。

　　1.4 实验动物分组

　　健康雄性新西兰大耳白兔40只(购于华中科技大学同济医学院实验动物学部，合格证号：医动字第19025号)，体质量(2.50±0.25)kg，分笼饲养。随机分为正常组(A组)、高脂组(B组)、小剂量美托洛尔组(C组)、大剂量美托洛尔组(D组)以及卡维地洛组(E组)，每组8只。

　　1.5 AS模型的制备及药物干预

　　家兔适应性喂养1周后，除正常组外，其余4组均一次性经耳缘静脉注射牛血清清蛋白250 mg/kg，然后均行高脂饮食。高脂饲料配方为：1 g胆固醇+5 g猪油+94 g普通饲料。另外，小、大剂量美托洛尔组每日清晨分别行美托洛尔10、20 mg/kg灌胃，卡维地洛组每日清晨行卡维地洛10 mg/kg灌胃，正常组每天给以100 mg普通饲料喂养。各组连续喂养10周，饲养过程中小、大剂量美托洛尔组各有1只家兔死于腹泻，高脂组有1只家兔死于过敏性休克。

　　1.6 血液标本的采集及检测

　　喂养10周后，各组动物均以250 g/L乌拉坦溶液4 mL/kg腹腔麻醉，沿胸骨正中线纵向剖开胸腔暴露心脏，直视下行右心室穿刺抽血。采用黄嘌呤氧化法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性，硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛(MDA)的含量，各操作步骤严格按说明书进行。

　　1.7 局部病理标本的取材及检测

　　高脂组、小剂量美托洛尔组、大剂量美托洛尔组及卡维地洛组动物均在主动脉弓病变处取材，大小约1.0 cm×0.5 cm;正常组亦在主动脉弓处取材，大小约1.0 cm×0.5 cm。标本分别放入40 g/L中性多聚甲醛中固定，逐步脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块。每一标本连续切片2张，分别用于PCNA及NFkBp65免疫组化检测，各操作步骤严格按说明书进行。

　　1.8 结果判断

　　PCNA及NFkBp65阳性表达主要在细胞核内，呈棕褐色。VIDAS 21计算机图像分析系统检测一定面积阳性信号面积值和阳性信号平均吸光度，并计算二者乘积，即积分吸光度。测定时每一病理切片在高倍镜(400倍)下随机取10个视野，取其平均值。

　　1.9 统计学分析

　　统计结果采用SPSS 11.5软件进行方差分析，组间比较采用q检验;变量间比较采用相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 SOD和MDA水平检测

　　与正常组比较，高脂组血清SOD活性明显降低，MDA含量增加，差异有显著意义(F=8.40、41.22,q=3.81、11.27,P<0.05);高脂组及小、大剂量美托洛尔组血清SOD活性和MDA含量比较无统计学差异(q=0.28～0.41,P>0.05);与高脂组及小、大剂量美托洛尔组比较，卡维地洛组血清SOD活性明显升高，血清MDA含量明显下降(q=1.13～9.45,P<0.05)。见表1。表1 各组家兔血清SOD活性及MDA水平比较

　　2.2 免疫组化检测

　　高脂组动物血管壁PCNA和NFkBp65的表达较正常组明显增加(F=138.46、78.67,q=54.32、32.59,P<0.05);高脂组及小、大剂量美托洛尔组、卡维地洛组血管壁PCNA和NFkBp65的表达依次减少，差异有显著性(q=28.89～78.41,P<0.05)。相关分析表明，各组PCNA和NFkBp65水平呈正相关(r=0.975，P<0.01)。见表2。表2 各组家兔血管壁PCNA及NFkBp65半定量检测结果比较

　　3 讨 论

　　AS为一较为复杂的病理学过程，其核心机制为脂质过氧化损伤血管壁，而平滑肌细胞的迁移增殖是斑块形成、管腔狭窄的直接原因。以往的研究结果表明，交感神经兴奋可致AS，而β受体阻滞剂可通过其抑制交感神经的作用发挥抗AS作用[3]。COMET研究显示，卡维地洛降心率作用是美托洛尔的2倍，因此本实验大剂量美托洛尔与卡维地洛采用了等效剂量。

　　3.1 美托洛尔与卡维地洛对脂质过氧化的影响

　　SOD与MDA是反映AS进展过程中氧化损伤的可靠指标。SOD是体内维持氧自由基产生与灭活的主要酶类，是清除氧自由基的“清道夫”;MDA是脂质过氧化生成的一种醛基，AS时其在血液中含量直接反映出氧化损伤的程度。本实验结果显示，美托洛尔抗氧化作用较弱，而卡维地洛却有明显的抗氧化效应。目前的研究表明，卡维地洛抗氧化作用的机制主要表现为：①抑制内源性抗氧化剂维生素E(Vit E)和谷光苷肽的清除。②与细胞膜上的Fe3+螯合，从而阻止由DHF/Fe3+ADP和Fe/Vit C介导的氧自由基产生，以及由其所致的细胞膜上的LDL氧化[4]。③作用于膜磷脂，降低膜对自由基的亲和性,并能镶嵌在脂质双层膜较深的位点上，使咔唑基接近脂质氧化的非饱和脂肪酸侧链的位点,从而发挥其抗氧化作用。④卡维地洛的代谢产物(SB211475和SB209995)抗氧化作用是卡维地洛的30～80倍,是Vit E的1 000～10 000倍。

　　3.2 美托洛尔与卡维地洛对PCNA和NFkBp65表达的影响

　　PCNA即增殖细胞核抗原，又称周期素,主要表达于处在增殖状态的细胞。细胞周期受PCNA控制,它作为生长因子的感受器,与周期蛋白依赖性激酶结合为外源信号的整合器,诱导蛋白磷酸化,从而调控细胞周期进程[5,6]。NFkB是将信息从胞浆传至胞核引起相应基因表达的重要的转录因子，它是由多肽链P65和P50蛋白亚基构成二聚体,本文即通过检测NFkBp65以明确AS病变中NFkB的活化程度。静止状态时NFkB位于细胞质中，当机体受到外界因素刺激时,在蛋白激酶核蛋白磷酸酶的作用下,抑制性kB(IkB)发生磷酸化,从NFkB二聚体上解离，NFkB得以激活,并移位入细胞核,与DNA链上调控众多因子转录的启动位点特异结合,启动基因转录[7]。有研究表明，在有丝分裂原(AngⅡ、FGF等)诱发的平滑肌细胞增殖的过程中，存在蛋白激酶C(PKC)NFkB信号转导通路，NFkB活化后可以结合在细胞cyclin D1的启动子而激活其转录，从而介导平滑肌细胞的增殖[8]。本实验结果显示,NFkBp65与PCNA呈正相关，也说明了NFkB可介导平滑肌细胞的增殖。美托洛尔抑制NFkB活化可能与其β受体阻断作用有关。有研究表明,交感神经兴奋可通过激活细胞内PKC的途径而发挥促平滑肌细胞增殖的作用[9]，而美托洛尔可通过阻断β受体抑制交感神经兴奋，从而抑制PKCNFkB通路介导的平滑肌细胞增殖。卡维地洛抑制NFkB活化的作用，一方面可能与其阻断α、β受体而抑制交感神经兴奋有关，另一方面其较强的抗氧化效应也发挥了重要的作用。HINZ等[10]研究显示，氧自由基可使IkB磷酸化降解而游离出NFkB进入核内,从而发挥其促平滑肌细胞增殖的作用。卡维地洛强烈的抗氧化作用，可清除AS病变过程中氧化损伤所释放的氧自由基，进而阻断其NFkB的活化，由此可抑制平滑肌细胞增殖。

　　总之，美托洛尔与卡维地洛具有明显的抗AS效应，并且可通过抑制NFkBp65的活化而阻断平滑肌细胞的增殖。美托洛尔抗AS效应呈剂量依赖性，而卡维地洛因具有明显的抗氧化作用其抗AS效应优于美托洛尔。

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