新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

　　作者：张琳 作者单位：徐州医学院内科学与诊断学教研室,江苏徐州221004

　　【摘要】 目的 探讨更为简单、有效的新生大鼠心肌细胞分离、培养方法。方法 取出生24 h内大鼠左心室，剪碎，0.125%胰蛋白酶、0.08%胶原酶 Ⅰ分离，离心收集心肌细胞，差速贴壁法和化学试剂抑制非心肌细胞生长，纯化后培养于DMEM培养基。免疫荧光鉴定纯度，0.4%台盼蓝染色检查心肌细胞成活率。结果 心肌细胞纯度为95%，平均成活率96%，并出现同簇细胞的同步跳动。结论 本研究应用改良的新生大鼠心肌细胞培养方法，心肌细胞存活率高，纯度高，且操作简便，重复性好，是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法，可满足实验要求。

　　【关键词】 心肌细胞 原代培养 胶原酶Ⅰ

　　An improved method for primary culture of neonate rat myocardial cell

　　ZHANG Lin1, LI Dongye2, WANG Zhirong3, XIA Yong3, ZHU Hong3, PAN Defeng2, ZHANG Zhuoqi2, YANG Yu3

　　(1. Department of Internal Medicine and Diagnostics, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221004, China;

　　2. Institute of Angiocardiopathy, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002; 3. Department of Cardiology,

　　Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)

　　Abstract: Objective To find an easy way to separate and culture the myocardial cells of rat neonate. Methods The left ventricular myocardium was removed from neonate rats within 24 hours after birth. The myocardial cells were separated by digestion with 0.125% trypsin and 0.08% collagenase I and collected by centrifugation. The myocardial cells were then cultured in DMEM and harvested by the time of adherence. The myocardial cells cultured were observed under light microscope, identified with cTnI and stained with 0.4% trypan blue to count the living cells. Results 95 percent of the cultured cells were myocardial cells and 96 percent of them were alive. All the myocardial cells were beating synchronously. Conclusion This is an effective way to obtain myocardial cells for scientific experimentation.

　　Key words: myocardial cell;primary culture;collagenaseⅠ

　　体外培养的心肌细胞具有自发节律性和收缩性特征，能够保持其在体内原有的许多结构和功能，同时排除了神经、体液等因素的干扰，可以从细胞、分子水平阐明一些基本理论，在心肌细胞生长发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要作用。因此，心肌细胞原代培养技术已广泛应用于心血管疾病机理及心血管药物和心脏组织工程学的研究。自1960年Harary等[1]首次对Wister乳鼠的心肌细胞进行培养并成功地维持其自发性节律搏动长达40天以来，国内外许多学者对心肌细胞原代培养方法不断地进行研究，但仍存在细胞存活率低、纯度不高等缺陷。笔者参照Simpson等[2]的培养方法并作了改进，摸索出一种简单并且稳定、可靠的心肌细胞培养方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和试剂 新生24 h内的SD大鼠10～15只，DMEM培养基(Gibco公司)，新生牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，Ⅰ型胶原酶(Gibco公司)，Brdu(Sigma公司)，磷酸盐缓冲溶液(PBS)(Sigma公司)，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)(Sigma公司)，0.4%台盼蓝(Sigma公司)，心肌肌钙蛋白I(cTnI)抗体(Santa Cruz公司)，FITC标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物公司)，明胶(Sigma公司)。

　　1.2 实验仪器 超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜、荧光倒置显微镜、离心机、HH-42快速恒温数显水箱等。所有手术器械均高压灭菌。玻璃器皿用强酸浸泡过夜，流水冲洗20遍，去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干后高压灭菌备用。

　　1.3 心肌细胞的制备和培养 新生24 h内的SD大鼠10～15只，碘伏浸泡5 min，固定四肢，75%的乙醇消毒皮肤，无菌眼科剪沿正中线入剪，再次用75%的乙醇消毒后沿胸骨正中入剪，注意避免剪破消化道以预防污染。无菌剪取心脏，仔细剥离心房及大血管组织，迅速置于预冷的不含Ca2+、Mg2+的PBS中，反复冲洗3遍，洗去残留的血细胞，将其剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小的组织块，放入锥形瓶中[3]，加入5倍体积的0.125%的胰蛋白酶和0.08%的胶原酶Ⅰ，37℃水浴，吸管吹打，消化5 min后弃上清。重复消化3次，收集每次消化后的上清液，加适量(与上清液等体积)含10%新生牛血清的DMEM培养基，终止消化酶的作用。细胞悬液经200目孔径不锈钢网滤除未消化组织，上清液离心10 min(850 r/min)，弃上清液，用含15%的新生牛血清、100万U青霉素、100万U 链霉素、pH=7.15的DMEM培养基吹散沉淀细胞，接种于培养瓶中，CO2培养箱(37℃，5% CO2，95%空气)中静置培养85 min，将培养液转移(差速贴壁)至明胶处理过的24孔培养板，CO2培养箱中继续培养，隔天换培养液，前3天加入0.1 mmol/L BrdU 抑制成纤维细胞生长。取培养72 h的单层细胞进行实验。

　　1.4 心肌细胞质量评价

　　1.4.1 心肌细胞形态学观察 光镜观察，常规倒置显微镜观察细胞形态。在倒置显微镜下观察培养液色泽变化;观察心肌细胞生长状态、形态变化;同时观察心肌细胞搏动的频率、节律、强度及范围，以判断心肌细胞培养是否成功和细胞生长是否良好。

　　1.4.2 台盼蓝拒染法计算细胞活力 心肌细胞用0.125%胰蛋白酶消化，充分吹打，制成单细胞悬液，稀释成2×108 个/L，取9滴细胞悬液移入小试管中，加等量0.4%台盼蓝溶液，混匀后用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。镜下观察，死细胞染成蓝色，而活细胞拒染。

　　细胞存活率=活细胞数/总细胞( 活细胞+死细胞 )数×100%

　　1.4.3 心肌细胞纯度鉴定 心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)免疫荧光鉴定计算心肌细胞比例：心肌细胞培养4天后弃培养液，4%多聚甲醛固定10～20 min，滴加cTnⅠ多克隆抗体(兔多克隆抗体1∶50)，4℃ 48 h;FITC标记二抗(羊抗兔1∶100)避光孵育2 h;液体石蜡封孔，荧光倒置相差显微镜观察、拍照。取6个视野拍照，计数荧光阳性细胞数作为心肌细胞数(n1)，镜下计数细胞总数目为(N1)。按公式计算：心肌细胞比例=∑n1/∑N1×100%。

　　2 结 果

　　2.1 倒置相差显微镜形态学观察 心肌组织消化后所有细胞均为圆形，培养12 h后可见梭形细胞，细胞逐渐增大，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动;24 h可见多角形细胞，并始见较多细胞搏动;48 h细胞形态为多角形或梭形，细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，铺满瓶底，有聚集生长趋势，形成所谓功能性合体细胞。72 h可见96%以上细胞自律搏动，搏动频率、节律、强度稳定，频率70～130次/min;大部分细胞相互连接，呈现同步搏动，同一批细胞的搏动频率一致(图1)。用含血清培养液培养2周后细胞搏动逐渐减弱，体积逐渐减小，1个月后逐渐死亡;而用无血清培养液较含血清培养液培养的细胞搏动弱、体积小，存活时间短。

　　2.2 心肌细胞活力测定结果 台盼蓝染色示活细胞数>96%。

　　2.3 心肌细胞纯度鉴定结果 心肌肌钙蛋白Ⅰ免疫荧光检测心肌细胞为梭形或多角形，纯度>95%(图2)。

　　图2 cTnⅠ鉴定心肌细胞纯度 (免疫荧光，×200)

　　3 讨 论

　　心肌细胞增殖能力低，大多数的实验来源于心肌细胞原代培养，原代培养成功与否直接关系到实验的进程，提高心肌细胞的存活率和纯度是心肌细胞培养成功的关键。我们对传统心肌细胞培养方法的进行了改良，总结如下。

　　3.1 新生大鼠鼠龄的选择 以往的观念认为新生大鼠在出生后3天内心肌细胞都有增殖能力，可用于心肌细胞培养，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖的能力。 但大鼠出生后时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。笔者通过大量实验观察认为最好选择出生24 h内新生大鼠，其心肌细胞培养效果最佳。

　　3.2 避免污染注意事项 手术操作过程严格无菌操作，动作迅速，尽量缩短心肌缺血缺氧时间。开胸前不要用碘酒消毒乳鼠皮肤，因碘酒易造成污染，宜用75%乙醇消毒;开胸时应尽量只剪开胸廓，不要打开腹腔[4];培养皿、血清、培养液、手术器械等要严格消毒;培养过程中每一步操作都应严格遵循实验原则和无菌要求;心肌细胞的观察、照相时间不可过长，次数不可太多，以每天不超过2次，每次不超过5 min为宜，否则能增加污染机率。

　　3.3 新生大鼠心肌细胞的分离 传统新生大鼠心肌细胞的分离方法有组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞生长而较少采用。消化法中较常用的消化酶有3种：胰蛋白酶、Ⅰ型或Ⅱ型胶原酶以及透明质酸酶[5]。胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损伤;胶原酶作用缓和， 主要用于消化细胞间质中的胶原纤维，以释放心肌细胞，对细胞损伤小，但难以消化完全[6];透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用[4]。在新生大鼠心肌组织中以胶原Ⅰ为主，故我们选用胶原酶Ⅰ[4]，现配现用。本研究选用胰蛋白酶浓度为0.125%，胶原酶Ⅰ浓度为0.08%，并进行分次消化以减轻胶原酶或胰蛋白酶对单细胞的破坏作用。消化温度在35℃～37℃左右，温度过高会增加胶原酶或胰蛋白酶的毒性，温度过低会降低胶原酶或胰蛋白酶的活性。缓慢恒温吹打心肌组织而不用恒温磁力搅拌器，以减少对心肌细胞的损伤。

　　3.4 心肌细胞的收集 无论何种酶消化的心肌细胞，第1次消化后静置的上清液均应弃去，因其含有残留血细胞和从组织边缘消化下来的坏死心肌细胞。收集消化后液体进行离心时，转速多为750～1000 r/min，因为离心时速度太快可对心肌细胞造成损伤，故本研究采用850 r/min 获得成功。

　　3.5 心肌细胞的纯化 体外培养的心肌细胞中通常存在2类细胞：心肌细胞(M细胞) 和成纤维细胞(F细胞)。由于成纤维细胞增殖迅速，培养3～5天后在数目上可大大超过心肌细胞数目，而对心肌细胞的生长、形态的观察、收缩功能、代谢都有很大影响;因此，体外培养心肌细胞的纯化方法就显得更为重要。目前国内外常用的纯化分离方法有：①差速贴壁法，根据心肌细胞和成纤维细胞在培养器皿表面贴壁生长的速度不同而分离的方法。有文献报道对M细胞和F细胞的分离所采用的贴壁时间是不同的，短的为20 min，长到3 h，一般为60～90 min[7] ，取得M细胞95%、F细胞93%。此方法具有操作简便、时间短、对细胞影响小、分离纯度高等优点，国外实验室多采用这种方法。纯化后培养的心肌细胞较混合培养的细胞搏动时间长，开始搏动的时间提前，易形成同步，且收缩力强。但该法的不足之处在于不适用于心肌细胞长期培养，因培养数天后成纤维细胞的比例就大大增加，本实验采用差速贴壁85 min分离纯化心肌细胞，纯度达到95%以上。②化学试剂抑制法，其原理是根据一些化学物质对一种细胞无明显影响，而对另一种细胞有抑制作用，从而可以分离出一种细胞，例如，溴脱氧尿苷、阿糖胞苷等可以抑制F细胞的DNA或蛋白质的合成，抑制F细胞的生长[8-9]。本研究选用0.1 mmol/L BrdU抑制成纤维细胞生长效果显著。③本实验还采取在培养液中添加新生牛血清而非胎牛血清的措施抑制非心肌细胞的生长，效果显著。

　　3.6 细胞的接种密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，而且影响长期培养细胞的成活率。文献报道心肌细胞密度多在5×107～5×109个/L。细胞密度过大，易发生营养不良; 细胞密度过小则心肌细胞黏附延展后不能相互接触，细胞之间无法进行信息交流，心肌细胞收缩不易同步，收缩持续时间变短。一般根据实验观测目的决定单位面积上的细胞数量。如果需要单个心肌细胞贴壁生长，供研究单细胞用，接种细胞的密度应低于108个/L。细胞密度为2×108个/L时，细胞可形成松疏的单层细胞网;细胞密度大于109个/L时，可形成单层细胞或多层细胞，或形成细胞簇。细胞密度较高时可观察到心肌细胞的搏动趋向同步化。

　　3.7 培养液的pH值 适宜、稳定的pH值是影响心肌细胞贴壁的关键因素之一。培养液的pH值一般控制在7.0～7.2之间，若pH值>7.6，心肌细胞生长受抑制，搏动也会减弱。若pH值<7.0，尤其pH值<6.8时会抑制细胞的生长。本研究选用pH值7.15。此外，配制及使用培养基时应注意：过滤后pH值上升0.1～0.3;配制好的培养基长时间贮存在4℃会使pH值上升，每次配好的培养基尽量在2周内用完。

　　3.8 换液与培养时间 为避免成活的心肌细胞随换液丢弃，应在接种后48 h首次换液，这样可使贴壁的心肌数目明显增加。培养时间不宜过长，培养4～5天后，心肌细胞与间质细胞之比可达3∶2，这不利于对心肌细胞功能的研究，一般在培养后72 h左右开始实验研究。

　　本研究通过用改良的乳鼠心肌细胞培养方法，心肌细胞存活率高，心肌细胞和非心肌细胞分离较彻底，细胞贴壁快，搏动早，纯度高，且操作简便，重复性好;是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法;可以满足心血管疾病发生、发展机理及心血管药物和心脏组织工程学的研究及多种生理生化实验的要求。

　　【参考文献】

　　[1] Harary I, Farley B. In vitro studies of single isolated beating heart cells[J]. Science,1960,131:1674-1675.

　　[2] Simpson P,Savion S.Differentiation of rat myocytes in singly cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells.Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol[J].Cire Res,1982,50(1):101-116

　　[3] 刘 丹，陈和平，何 明.新生大鼠心肌细胞分离与原代培养[J].江西医学院学报，2005，45(5)：53-55.

　　[4] 王 涛,余志斌,谢满江,等.新生大鼠心肌细胞培养技巧[J].第四军医大学学报，2003，24(2)：封2.

　　[5] Kono T. Roles of collagenase and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues [J]. Biochim Biophys Acta,1969,178(2):397-400.

　　[6] 李润琴，慕晓玲.新生大鼠心肌细胞培养技术[J].山西医药杂志,2007,36(2):103-105.

　　[7] Bes S, Roussel P, Laubriet A, et al. Influence of deep hypothermia on the tolerance of the isolated cardiomycyte to ischemia-reperfusion [J]. J Mol Cell Cardiol,2001,33(11):1973-1988.

　　[8] Miragoli M, Gaudesius G, Rohr S. Electrotonic modulation of cardiac impulse conduction by myofibroblasts [J]. Circ Res,2006,98(6):801-810.

　　[9] Clark WA, Decker ML, Behnke-Barclay M, et al. Cell contact as an independent factor modulating cardiac myocyte hypertrophy and survival in long-term primary culture [J]. J Mol Cell Cardiol,1998,30(1):39-155.