重组人脑利钠肽对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤的保护作用

　　作者：王丽 赵学忠 于晓风 曲绍春 睢大筼 周大亮 胡金涛 作者单位：吉林大学第一医院心血管内科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 观察重组人脑利钠肽(rhBNP)对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法 制备实验性心肌缺血再灌注损伤模型，随机分为假手术组、模型组、rhBNP组，rhBNP按0.1 mg/kg，通过舌下静脉给药，其他组给予等容积生理盐水，然后计算心肌梗死面积(MIS)，NBT染色心肌标本，测定心肌酶学、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)活性及丙二醛(MDA)含量。结果 与假手术组比较，模型组的心肌染色变浅,梗死重量和MIS及AST、LDH、CK活性均明显升高(P<0.05～P<0.001)，SOD活性明显下降，MDA及MPO含量均明显增加(P<0.05);与模型组比较，rhBNP组的心肌染色变深，梗死重量和MIS及AST、LDH、CK活性均明显下降，SOD活性明显升高，MDA及MPO含量均明显降低。结论 rhBNP对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤具有明显保护作用。

　　【关键词】 重组人脑利钠肽;心肌缺血再灌注损伤;心肌酶;自由基

　　重组人脑利钠肽(rhBNP)主要用于急性心力衰竭的治疗〔1〕。有实验证明rhBNP可以扩张冠状动脉，提高冠脉血流量，增加心肌供血供氧〔2～4〕。但rhBNP对于心肌缺血再灌注损伤的作用少见报道。本实验通过观察rhBNP对实验性大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制，为心肌缺血再灌注损伤治疗的新方法提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　30只Wistar大鼠，雌雄各半，体重200～250 g，由吉林大学实验动物中心提供。

　　1.2 主要药品及试剂

　　rhBNP(西藏药业公司);氯化硝基四氮唑蓝(NBT)(上海前进试剂厂);丙二醛(MDA) 、超氧化物歧化酶( SOD)及髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒(南京建成生物研究所)。乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)在7150型全自动生化分析仪(日本)上测定。

　　1.3 大鼠模型的建立

　　30只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组及rhBNP组，每组10只。大鼠冠脉结扎按文献〔5〕方法稍加改进，在乙醚麻醉下仰位固定于手术台，自左侧3～4肋间开胸，暴露心脏，于肺动脉圆锥及左心房间找出冠脉左前降支，除假手术组仅穿线不结扎外，其余各组均以0号线立即结扎冠脉，结扎时用一细小乳胶管垫于血管与结扎线之间，将心脏送回胸腔，并挤出胸腔内血液和气体，迅速关闭胸腔，开胸时间不超过30 s。rhBNP按0.1 mg/kg给予相应剂量的药物，假手术组及模型组给予等容积的生理盐水。于结扎后立即舌下静脉给予相应组别的药物，给药容积0.2 ml/100 g体重。

　　1.4 心肌标本的染色和心肌梗死面积的测定

　　取血后剖取大鼠心脏，用生理盐水洗净心腔内积血，去掉心房组织及脂肪，称重，将左心室心肌横切4片，然后浸入NBT磷酸缓冲液中，置37℃恒温水浴，待染色完全后取出，用数码相机记录心肌标本，正常组织染色，梗死组织不染色。切下梗死心肌称重，用梗死心肌与左心室湿重的百分比计算心肌梗死面积(MIS)〔6〕。

　　1.5 生化指标的测定

　　各组动物在结扎30 min后松解结扎线进行再灌注，再灌注4 h后，以戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉插管取血，检测血清AST、LDH和CKMB活性;按试剂盒方法测血清MDA含量，SOD、MPO活性。

　　1.6 统计学方法

　　实验结果均以x±s表示，应用统计学软件SPSS12.0进行处理，两样本均数组间比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 rhBNP对实验性心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

　　与假手术组相比，模型组大鼠的NBT染色浅，梗死重量、MIS(P<0.001)及血清AST、LDH、CKMB均显著升高(P<0.01或P<0.001)。与模型组比较，rhBNP组大鼠的心肌NBT染色深，梗死重量、MIS明显缩小(P<0.001，P<0.01)，血清AST、LDH及CKMB活性明显降低(P<0.05或P<0.01)，见表1，表2及图1。表1 rhBNP对于实验性心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积的影响，表2 rhBNP对于实验性心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌酶学的影响(略)。

　　2.2 rhBNP对实验性心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激的影响

　　与假手术组相比，模型组血清MDA、MPO含量明显增加，而SOD活性明显降低(P<0.05)。与模型组比较，rhBNP大鼠的血清MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD活性显著提高，MPO活性显著降低(P<0.05)，见表3。表3 实验性心肌缺血再灌注损伤大鼠血清MDA、SOD及MPO水平(略)

　　3 讨论

　　心肌细胞缺血再灌注损伤时，心肌标本NBT染色变浅，梗死范围增大，梗死重量及MIS均增加。MIS与左室舒张期末压之间呈平行关系，左心室MIS愈大,左室舒缩性能降低愈明显,恢复愈差〔7〕。心肌细胞损伤时，细胞膜的完整性遭到破坏，细胞内的大分子物质(血清心脏标记物)开始弥散至心脏间质组织并最后进入梗死区的血液中。心肌细胞损伤时CK溢出越多，活性越高，反映心肌损伤程度越重〔8〕。LDH增加可反映细胞膜的损伤，其外漏的程度也可间接反映心肌再灌注受损程度〔9〕。因此，心肌梗死重量和MIS及血清CK、LDH及AST的活性测定可作为观察心肌缺血再灌注损伤程度及药物抗心肌缺血再灌注损伤疗效和预后的指标之一。本实验表明，rhBNP能明显缩小心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌梗死面积，NBT染色变深，明显降低梗死重量和MIS及血清CK、LDH 和AST活性，证实其对缺血再灌注心肌具有明显保护作用。

　　心肌缺血再灌注损伤时，自由基的产生及其介导的脂质过氧化反应是心肌缺血再灌注损伤重要环节之一〔10〕，心肌缺血再灌注时随着大量氧的涌入，致使氧自由基大量产生,后者与心肌细胞膜上的多价不饱和脂肪酸发生连锁反应,造成细胞膜的脂质过氧化,使膜电位不稳定，触发严重的心律失常〔11〕。MDA是脂质过氧化的共同产物,细胞中MDA水平常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映心肌细胞受自由基攻击的严重程度和细胞损伤的程度，因此MDA是评价心肌缺血损伤的较好指标之一〔12〕。有研究表明早期冠脉内皮细胞损伤和其后所引发的中性粒细胞聚积是缺血再灌注损伤过程中的两个关键的阶段〔13〕。MPO是存在于中性粒细胞、单核细胞中嗜天青颗粒内的一种氧化酶，炎症时被释放到细胞外，通过与过氧化氢(H2O2)作用，产生次氯酸等强氧化剂，进而造成邻近组织损伤，MPO的活性愈强，炎症损害愈严重，即缺血再灌注损伤愈重。氧自由基极易与其他物质反应，生成新的自由基，如羟自由基，其活性更强,能引起细胞膜的结构和功能更大的损伤，从而加剧缺血心肌的损伤。SOD能清除氧自由基，阻断脂质过氧化的链式反应。因此，SOD活力的高低可反映机体清除氧自由基的能力。本实验观察到rhBNP组与模型组比较，MDA及MPO含量明显减少，血清SOD活性显著升高，表明rhBNP可降低缺血再灌注损伤大鼠血清MDA、MPO含量，提高SOD活性。说明rhBNP保护缺血再灌注损伤的作用机制可能与其增强抗氧化酶活性，减少自由基对心肌的氧化损伤有关。

　　此外，缺血再灌注损伤机制还包括微血管损伤等，rhBNP 还可能通过直接扩张冠脉血管及微血管，对抗神经激素应激导致的冠状动脉及微血管痉挛，增加冠脉及微血管血流量，减轻心肌缺血症状及微血管损伤，从而发挥保护缺血再灌注损伤心肌的作用。

　　【参考文献】

　　1 袁长玲，张 雷.重组人脑利钠肽治疗重症充血性心力衰竭临床观察〔J〕.实用医技杂志，2009;12(16)：9978.

　　2 D′Souza SP，Yellon DM，Martin C,et al.B type natriuretic peptide limits infarct size in rat isolated hearts via KATP channel opening〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003;284(5)：H1592H600.

　　3 Tsuruda T，Boerrigter G，Huntley BK,et al.Brain natriuretic peptide is produced in cardiac fibroblasts and induces matrix metalloproteinases〔J〕. Circ Res，2002;13(27):112734.

　　4 董玲玲,崔雪阳,孙志军，等.重组人脑利钠肽治疗心力衰竭的研究进展〔J〕.实用药物与临床，2009;12(4)：2813.

　　5 杨建业，张迎春.大鼠缺血再灌注后心功能变化与心肌梗死面积的相关性分析〔J〕.实验动物与比较医学，2008;28(1)：49.

　　6 杨 简,杨 俊.腺苷介导大鼠心脏缺血后适应的保护效应〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2008;10(4)：2936.

　　7 Hama N,Itoh H，Shirakami G,et al.Rapid ventricular induction of brain natriuretic peptide gene expression in experimental acute myocardiol infarction〔J〕.Circulation，1995;92(6)：155864.

　　8 顾迎春，于晓玲，郭维军.川芎嗪后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.国际心血管杂志，2009;9(36)：9.

　　9 高恩宇.养心颗粒对心肌缺血再灌注损伤大鼠模型血清乳酸脱氢酶的影响〔D〕.黑龙江中医药大学，2009：.

　　10 Zhao W，Fan GC.Protection of peroxiredoxin II on oxidative stress induced cardiomyocyte death and apoptosis〔J〕.Basic Res Cardiol，2009;104(4)：37789.

　　11 孙 涛，苏全生.自由基与心肌缺血/再灌注损伤〔J〕.实用医院临床杂志，2006;3(4) ：946.

　　12 周玖瑶，李 锐，廖雪珍，等.抗垂体后叶素致心肌缺血作用机理研究〔J〕.广州中医药大学学报，2005;22(6) ：4547.

　　13 孙 潇，姜恩平， 陈建光.北五味子总木脂素对高脂血症大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2009;39(2)：2769.