血管紧张素Ⅱ和去甲肾上腺素致心肌肥厚作用的实验研究

　　作者：付 锦 孙 冰 张一娜 尚 宏 　作者单位:150086黑龙江哈尔滨医科大学附属第二医院老年病科

　　【摘要】 目的 比较血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和去甲肾上腺素(NE)致SD大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞蛋白合成作用的特点及机制，探讨AngⅡ和NE受体拮抗剂对心肌肥厚的逆转作用。 方法 检测心肌细胞 3 H-leu掺入和心肌成纤维细胞 3 H-TdR掺入率。 结果 10 -6 M的NE可明显增加心肌细胞 3 H-leu掺入(P<0.01);等量哌唑嗪(PRAZ)及普萘洛尔(pronel)可阻断这一作用。NE可以增加心肌成纤维细胞的 3 H-TdR掺入(P<0.01)，等量pronel可以完全阻断其作用。10 -6 M AngⅡ能够明显增加心肌成纤维细胞的 3 H-TdR掺入(P<0.01)及心肌细胞 3 H-leu掺入(P<0.05);心肌成纤维细胞培养上清液，使心肌细胞 3 H-leu掺入增加更显著(P<0.01)。AT 1 受体拮抗剂可以完全阻断其作用。 结论 α 1 、β受体拮抗剂和AT 1 受体拮抗剂均可阻断心肌细胞蛋白合成。β受体拮抗剂和AT 1 受体拮抗剂尚可阻断心肌成纤维细胞增殖。

　　关键词 心肌肥厚 去甲肾上腺素 血管紧张素Ⅱ

　　Experimental research on role of norepinephrine and angiotensinⅡto induce cardiac hypertrophy

　　Fu Jin，Sun Bing，Zhang Yi'na，et al.

　　Department of Geriatrics，The Second Hospital Affiliated to Harbin Medical University，Heilongjiang150086.

　　【Abstract】 Objective To study and compare the role and its mechanism of norepinephrine(NE)and an-giotensinⅡ(AngⅡ)to induce cardiac hypertrophy.Methods Cardiomyocyte(CM)and cardiac fibroblast(CFB)in SD rat were cultured in vitro，and the 3 H-leu incorporation of CM and 3 H-TdR incorporation of CFB were detected respectively to oberserve the role of NE and AngⅡ.Results 10 -6 MNE could increase 3 H-leu incorporation of CM(P<0.01)，PRAZ and pronel with same concentration could block these effects.Moreover，NE could augment 3 H-TdR incorporation of CFB，pronel with same amount could block this effect completely.10 -6 M AngⅡcould enhance 3 H-leu incorporation of CM(P<0.01)and 3 H-TdR incorporation of CFB(P<0.01)，moreover， 3 H-leu incor-poration of CM could be increased further after adding supernatant of cultured CFB(P<0.01).The effects were blocked by AT 1 receptor antagonist.Conclusion Our results provide experiment basis for early usage ofα 1 andβre-ceptor antagonist and AT 1 receptor antagonist to prevent cardiac hypertrophy clinically，especially cardiac interstitial hypertrophy.

　　Key words cardiac hypertrophy norepinephrine angiotesinⅡ

　　研究表明 [1] 机械因素是影响心肌肥厚发展与转归的主导力量，但许多内分泌因子如儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、甲状腺素和内皮素等通过多种机制与途径亦影响心肌肥厚的发生与发展，并与机械因素相互作用和影响。其中儿茶酚胺 [2] 、AngⅡ在许多心血管疾病的病理发生中代偿性增高，故其对心肌肥厚的影响尤为重要，但是关于它们作用特点的研究和比较，目前国内外研究报道较少。本文应用新生SD大鼠心肌细胞及占心肌间质90%的心肌成纤维细胞的体外培养的上清液研究去甲肾上腺素(NE)和AngⅡ分别对心肌细胞及心肌成纤维细胞的作用及特点，以期为心肌肥厚的防治提供理论指导。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验方法

　　1.1.1 心肌细胞(CM)的培养 取新生1d的SD乳鼠心脏(由哈尔滨医科大学附属二院实验动物中心提供)，按Simp-son改良法分离和收集细胞，细胞收集于含20%胎牛血清的DMEM中。按1×10 5 /孔细胞浓度接种于24孔板，5%CO 2 ，37℃的培养箱中孵育48h换培养基，72h后换无血清培养基，再培养24h进入实验，分组加干预因素。

　　1.1.2 心肌成纤维细胞(CFB)培养 取新生1d的SD乳鼠心脏，采用酶解法将左心室肌消化成单细胞悬液，经差速贴壁分离法分离出CFB，应用含20%胎牛血清的DMEM于37℃，5%CO 2 的培养箱中孵育每3d换液1次，第2代细胞进入实验。经上述方法制备的CFB波形蛋白抗体免疫组化染色阳性细胞占90%以上。

　　1.1.3 CM 3 H-leu掺入的测定 加药物干预的同时，在培养孔中加入1μCi 3 H-亮氨酸( 3 H-leu购于中国原子能研究院)，培养24h终止反应，去培养液，用预冷的10%三氯乙酸于4℃固定30min，然后用平行盐溶液洗2次。最后用0.1mol/L NaOH溶液裂解细胞，37℃放置过夜。次日放入有闪烁液的测量杯中，液闪计数仪上测放射性强度。

　　1.1.4 CFB 3 H-TdR掺入的测定 细胞以2.5×10 4 /孔接种于24孔板，48h后换以无血清培养基孵育48h，使细胞处于G 0 /G 1 期，换培养基加药物干预的同时，在培养孔中加入1μCi 3 H-腺苷( 3 H-TdR购于中国原子能研究院)，培养24h终止反应，0.45μl微孔滤膜负压抽滤，生理盐水和10%三氯乙酸先后冲洗滤膜，滤膜干燥后置于内含4ml PPO/POPOP/二甲苯闪烁液的闪烁瓶中过夜，液闪计数仪上测放射性强度。

　　1.2 实验分组

　　1.2.1 CM组 按1×10 5 /(孔?200μl)将CM接种于24孔板，一共6组，每组设4个平行孔:(1)对照组(C);(2)NE组(N);(3)NE+α 1 受体拮抗剂哌唑嗪(PRAZ)组(N+PRA);(4)NE+β受体拮抗剂心得安(pronel)组(N+Pro);(5)AngⅡ组(A);(6)AngⅡ+AngⅡ1型受体(AT 1 )拮抗剂洛沙坦(losartan)组(A+L)。NE、pronel和PRAZ的实验浓度均为10 -6 M;AngⅡ和losartan实验浓度均为10 -6 M，加入干预因素同时加入 3 H-leu和 3 H-TdR。

　　1.2.2 CFB组 以2.5×10 4 /(孔?200μl)将CFB接种于24孔板，共分6组:A:对照组(C);B:NE组(N);C:NE+PRAZ组(N+PRA);D:NE+pronel组(N+Pro);E:AngⅡ组(A);F:AngⅡ+losartan组(A+L)。

　　1.2.3 混合组 按1×10 5 /(孔?200μl)将CM接种于24孔板，分4组:对照组(C);AngⅡ组(A);AngⅡ+CFB培养上清组(A+CS);AngⅡ+losartan+CFB上清组(A+L+CS)。再以2.5×10 4 (孔?200μl)将CFB接种于24孔板，分为E、F两组。E、F组分别加入AngⅡ、AngⅡ+losartan孵育12h后分别收集2组上清，各取100μl分别加入A+CS组和A+L+CS组心肌细胞孔，加入前，A+CS和A+L+CS两组各孔弃上清100μl。最后使AngⅡ和losartan实验浓度为10 -6 M。各孔分别加入1μCi 3 H-leu孵育24h。

　　1.3 统计学方法 所有数据应用Instat统计软件分析，以均数±标准差(ˉx±s)表示。组间样本比较采用Student-t检验。

　　2 结果

　　2.1 AngⅡ和NE对心肌细胞 3 H-leu掺入的影响 10 -6 M的NE可使心肌细胞的 3 H-leu掺入显著增加(P<0.01)，等量的PRAZ和pronel可分别阻断其作用(P<0.01)。10 -6 M的AngⅡ可增加心肌细胞 3 H-leu(P<0.05)掺入，等量的losartan可完全阻断。见表1。

　　表1 AngⅡ和NE对心肌细胞 3 H-leu掺入的影响 组别 例数 3 H-leu掺入(略)注: * P<0.05， ** P<0.01

　　2.2 AngⅡ和NE对心肌成纤维细胞的影响 10 -6 M的NE和AngⅡ均可使心肌成纤维细胞的 3 H-TdR掺入显著增加(P<0.01)，并分别为等量的pronel和losartan完全阻断(P <0.01)。见表2。

　　表2 AngⅡ和NE对心肌成纤维细胞的影响 组别 例数 3 H-TdR掺入(略)注: * P<0.05， ** P<0.01

　　2.3 心肌成纤维细胞在AngⅡ致心肌细胞肥大中的作用 10 -6 M的AngⅡ可使心肌细胞 3 H-leu掺入明显增加(P<0.05)。但在加入成纤维细胞培养液上清后心肌细胞的 3 H-leu掺入增加更显著(P<0.01)，等量的losartan可完全阻断其作用(P<0.01)。见表3。

　　表3 心肌成纤维细胞在AngⅡ致心肌细胞肥大中(略)注: * P<0.05， ** P<0.01

　　3 讨论

　　儿茶酚胺对心肌细胞肥大的作用主要通过Gq-Ras-Raf-ERK旁路或激活PKC信号旁路，产生三磷酸肌醇和二脂酰甘油后活化蛋白激酶传导的，信号传导最后作用于细胞核，在30min内，所谓早期应答基因(c-fos，c-jun，c-myc)即开始活化。这些基因的表达是所有丧失了分裂再生能力的终末分化细胞受到诱导生长时的共同表现。6～12h后，胎儿基因如:β-MHC，α-SkA等开始表达。这一系列改变致使心肌细胞的收缩蛋白表型发生了改变，发生了向胎儿时期的转变，心肌细胞蛋白合成增加，体积变大，即发生了心肌肥大 [3] 。笔者的研究结果表明:NE能够通过α 1 及β受体明显增加心肌蛋白质合成，促进心肌细胞肥大，并通过β受体促进心肌成纤维细胞的分裂和增殖。因此，在一些心血管疾病如:冠心病、高血压心脏病和心力衰竭等的早期使用α和β受体拮抗剂，不仅可以阻断交感神经兴奋性，增强对心血管系统的不良作用，而且对于预防心肌细胞肥大，心肌成纤维细胞分裂增殖进而防治心肌间质纤维化和心衰，亦是有益的。从预防心肌肥大的角度考虑，兼有α 1 和β受体拮抗作用的药物如达利全，可能具有更完全的保护作用。以往的研究多注意儿茶酚胺促心肌细胞肥大的研究，笔者的实验证明它对心肌成纤维细胞同样具有促进增殖与分裂的作用，而心肌成纤维细胞不同于心肌细胞，出生后仍可分裂增殖，因此，阻断儿茶酚胺对心肌间质的影响可能更具临床意义。心肌细胞只占了心肌组织的1/3，其它非心肌细胞90%以上是心肌成纤维细胞，心肌成纤维细胞主要分泌构成心肌间质网络的基本结构蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原，由纤维连接素将它们锚定于心肌细胞和成纤维细胞膜上，Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原垂直排列，形成细小的网状结构。因此，心肌成纤维细胞的增生和合成分泌胶原量及种类的变化，即心肌间质构型的重建与心肌细胞肥大在心肌肥厚中具有同等或更重要的病理意义 [4] 。笔者的研究结果显示:AngⅡ对心肌细胞和心肌成纤维细胞具有直接的促进分裂和增殖的作用，但在加入心肌成纤维细胞培养的上清液后促心肌细胞肥大作用更为明显。说明AngⅡ对心肌成纤维细胞的影响更为重要。研究表明:成纤维细胞上AngⅡ受体的密度是心肌细胞上的7.3倍，心肌成纤维细胞在AngⅡ的刺激下，可分泌成纤维细胞源因子和转化生长因子等，通过自分泌和旁分泌作用来刺激心肌细胞生长 [5] 。从实验结果可见，AngⅡ和NE对心肌细胞和心肌成纤维细胞均具有促进蛋白合成和分裂增殖的作用，相比较而言AngⅡ主要作用于心肌成纤维细胞，影响心肌间质的增生与重塑，并通过心肌成纤维细胞进一步对心肌细胞发挥促肥大作用。而NE对心肌和心肌成纤维细胞均有明显的直接影响。研究结果证明肾上腺素能受体拮抗剂和AT 1 受体拮抗剂，对于改善心肌的重塑，尤其是对于心肌间质的重构，预防心肌间质纤维化，具有重要意义，为其临床应用提供了实验基础。

　　参考文献

　　1 张明娟，吕卓人.心肌肥厚发生机制的研究进展.中国实用内科杂志，2002，7:437-439.

　　2 孙冰，付锦，张一娜.去甲肾上腺素诱导心肌细胞肥大的机制.临床心血管杂志，2004，4:35-37.

　　3 Hefti MA，Harfer BA，Eppenberger HM，et al.Signaling pathways in cardiac myocyte hypertrophy.Mol Cell Cardiol，1997，29:2873-2892.

　　4 王保华，区克阳，刘永明，等.甲状腺素对血管紧张素Ⅱ所致的心肌成纤维细胞胶原合成改变的影响.武汉大学学报，2002，1:1-3.

　　5 王新凤，高广道.心肌成纤维细胞分泌生长因子在心肌重塑中的作用.国外医学?心血管疾病分册，2002，292:73-75.