骨桥蛋白及其在动脉粥样硬化中的作用

　　作者：崇爱国，刘伏元    作者单位：安徽医科大学附属省立医院心内科，安徽 合肥 230001　　【关键词】  骨桥蛋白；动脉粥样硬化；诊断

　　骨桥蛋白(osteopontin，OPN）是细胞外基质中一种重要的糖蛋白，骨组织中大量存在，其他组织中也有少量的表达，但正常血管壁中几乎不表达。1986年以前曾被称为早期T淋巴细胞活性1（early  T lymphocyte  activation，Eta-1）、分泌性磷蛋白1（secrected phosphoprotein 1，SSP-1）、骨唾液酸蛋白1（bone sialoprotein 1，BSP-1），自从被命名为OPN以来，已相继克隆了大鼠、小鼠、猪、牛、鸡和兔的OPN cDNA。近来研究发现在血管壁动脉粥样硬化处的内皮细胞和平滑肌细胞内OPN mRNA呈高表达状态。它在动脉粥样硬化中的作用己经引起人们的关注。本文就OPN及其在动脉粥样硬化中的作用作一综述。

　　1  骨桥蛋白的结构特征

　　由于来源的生物种系不同，OPN由264-314个氨基酸残基组成，其中天冬氨酸、谷氨酸、以及丝氨酸残基所占的比例较高。OPN中含有单糖链，既有N-糖基化位点，又有O-糖基化位点。OPN具有以下结构特征：（１）精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列：RGD序列可与细胞表面整合素受体 avβ、avβ 3、avβ 5等结合，介导糖蛋白与细胞间的粘附过程。有研究表明：过度表达OPN的乳腺癌细胞经淋巴管侵润明显增强，失去RGD序列后可部分消除此现象[1]，RGD序列具有高度保守性，一旦变异或缺失将丧失其促粘附的功能；(2）凝血酶裂解位点：OPN能够被凝血酶水解成两个大小不同的肽链，此酶作用位点在RGD序列竣基端第6位氨基酸残基所形成的肽键。研究证明，与完整的OPN分子相比，被凝血酶裂解后含有RGD序列的N末端片断促进粘附的功能反而加强，而缺乏RGD序列的氨基片断其粘附能力减弱；(3）基质金属蛋白酶（MMP）作用位点：目前发现在OPN分子中存在3个MMP上的酶切位点和2个MMP-7的酶切位点[2]。与凝血酶的功能相似，OPN经MMP-3或MMP-7酶切以后其诱导巨噬细胞迁移的功能明显增强；(4）非RGD细胞粘附位点：在骨桥蛋白的羧基末端序列中，还有一段非RGD的细胞粘附位点，OPN以非RGD依赖方式与细胞表面CD44结合而发挥细胞信号分子的作用，其主要与细胞免疫有关[3]；(5）钙离子结合位点：酪氨酸蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶C等能催化骨桥蛋白分子中丝氨酸和苏氨酸残基发生磷酸化，磷酸化的OPN可与多个Ca2+结合在一起。

　　2  骨桥蛋白的组织分布

　　正常情况下，OPN主要存在于骨组织中，但是在病理过程中，许多种细胞可以产生OPN，如：内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞(SMC)成纤维细胞、活化的T淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK）等。在正常的动脉壁OPN表达甚微或几乎不表达，但是Cherida等人用免疫组织化学染色（immunohistochemical staining）发现在动脉粥样斑块处的泡沫细胞中或者钙化的部位OPN表达明显增加[４]，人主动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞都可以表达OPN mRNA及合成OPN。内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞与OPN的作用依赖于RGD和Ca２+，抗 avβ 3抗体可部分阻滞这些细胞向OPN迁移。近来研究表明，OPN作为一个细胞因子调节细胞功能而参与组织修复和炎症过程[５]，研究发现在疾病和组织损伤引起的炎症部位OPN的水平增高。

　　3  骨桥蛋白表达的诱导因素

　　研究发现，正常情况下其表达甚微的细胞，如：巨噬细胞、SMC、T淋巴细胞、成纤维细胞等在一些诱导因素下可以大量表达OPN，包括：（１）高血压：Ｉizuka等[６]把人主动脉平滑肌细胞暴露在160 mmHg的高压下3h，然后再培养，结果3h后发现高压组同非高压组相比细胞增殖11％。免疫印迹分析发现，培养8 h以内OPN的表达没有明显的改变，24h后OPN表达比对照组增加大约50％；(2）高血糖：糖尿病人群中动脉粥样硬化的患病率较高，在糖尿病状态下，大鼠近端小管细胞中OPN表达上调[7]，另外，无论是人类还是大鼠，其动脉中膜平滑肌细胞的OPN表达均明显亢进。Takenoto等[8]对培养的大鼠主动脉平滑肌的研究表明，OPN在高浓度葡萄糖(25mmol/L）状态下，通过蛋白激酶C(PKC）活化，在转录水平上表达明显增加。高浓度葡萄糖处理的平滑肌细胞表达OPN增加可被PKC抑制剂GF109203X抑制；（3）低氧：对大鼠主动脉平滑肌细胞进行研究发现，在缺氧（3％Ｏ２） 2 h后OPN  mRNA及OPN 蛋白的表达增加，6、12 h后下降，24 h后又增加。PKC和P38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂可以明显减弱缺氧诱导的OPN表达，高浓度葡萄糖可以加强缺氧诱导的OPN表达[９]；（4）干扰素：IFN-γ（1 000 U／ml）明显刺激平滑肌细胞内骨桥蛋白的表达，Western|blotting分析24 h干预组OPN量较对照组提高71.18％，48 h后较对照组提高75.66％，说明IFN-γ能在基因水平上刺激大鼠平滑肌细胞内OPN的表达[10]；（5）成纤维细胞生长因子：Li等[１１]研究发现，成纤维细胞生长因子-１（ＦＧF-１）可以与其受体结合刺激大鼠主动脉平滑肌细胞表达OPN mRNA及OPN蛋白，高度选择性的FGF-１受体酪氨酸激酶（Src）抑制剂PD166866可以减弱FGF-l诱导的OPN mRNA表达，另外PP２（Src特异性抑制剂）和丝裂原细胞外信号反应激酶（MEK）抑制剂PD98059都可以减弱FGF-l诱导的OPN 表达。说明ＦＧF-１与FGFR-１结合在转录水平上通过Src/ＭEK／MAP信号路径上调OPN的表达，通过OPN的表达可以介导成纤维细胞的迁移；（６）其他因素：内皮素-１、胰岛素样生长因子（ＩGF）、血小板源生长因子（PDGF）内皮细胞生长因子样因子（EGF样因子）、转化生长因子β（ＴＧＦ-β）、AngⅡ和ＵＴＰ等均能刺激血管内皮细胞和平滑肌细胞表达骨桥蛋白分子[１２]。

　　4  骨桥蛋白在动脉粥样硬化（AS）中的作用

　　有一种学说认为AS各种主要危险因素最终都损伤动脉内膜，内膜受损的同时还释放出多种细胞因子，而粥样斑块的形成是动脉对内膜损伤作出反应的结果。在这种损伤反应中，平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞起到了非常重要的作用。这些细胞的活动和OPN存在着密切的关系。

　　4.1  ＯPN与血管平滑肌细胞的增殖和迁移

　　血管壁的平滑肌细胞正常位于中膜，AS发生时内膜斑块中有大量的平滑肌细胞来源的泡沫细胞，血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移和增殖是AS发生的关键内容之一。根据功能和结构不同，ASMC可以分为收缩型和合成型两种，OPN被认为是平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转化的标志基因。由收缩型向合成型转化是VSMC增殖的必要条件。OPN与平滑肌细胞的迁移和增殖有关，Chaulet[１3]等体外实验证实细胞外核苷酸尤其是尿苷三磷酸（UTP）诱导动脉平滑肌细胞的迁移是通过OPN来实现的。体外培养的或体内血管损伤部位病变中存在的VSMC可合成分泌大量的OPN，后者与细胞的粘附和迁移能力具有明显的量效和／或时效依赖关系[１4]，整合素 β3-粘着斑激酶（ＦAK）是介导VSMC迁移的重要信号途径，FAK磷酸化特异性抑制剂粘着斑相关非激酶（ＦRNK），可以下调β 3表达、抑制FAK磷酸化和减少粘着斑蛋白磷酸化及粘着斑形成而发挥抑制OPN，促VSMC迁移的效应[１５]。OPN与VSMC结合还能刺激基质金属蛋白酶（MMP）产生，从而更利于VSMC通过细胞外基质而发生迁移。Isoda[１6]用OPN转基因小鼠研究发现，在无损伤条件下主动脉中膜增厚而且OPN表达水平较高，OPN基本上来自于中膜的平滑肌细胞。增殖细胞核抗原（ＰCNA）染色显示中膜平滑肌细胞处于活跃增殖状态，表明OPN转基因小鼠中膜增厚归因子SMC的增殖。在损伤条件下，OPN转基因小鼠会有新生内膜的形成。一些致动脉粥样硬化的生长因子和细胞因子如：PDGF、FGF、TGFβ、血管紧张素（Ang）Ⅱ等都可以诱导血管平滑肌细胞表达OPN，用整合素拮抗剂及OPN抗体可以抑制新内膜的形成。说明调控OPN的转录和表达在动脉粥样硬化中起到重要的作用。

　　4.2  OPN对巨噬细胞趋化作用

　　OPN是一个强大的巨噬细胞粘附趋化因子，巨噬细胞表面表达大量与OPN有高度亲和力的受体。研究发现OPN可以诱导早期单核／巨噬细胞渗透到肾间质，并且在巨噬细胞单克隆刺激因子（M-CSF）的作用下发生增殖。心肌梗塞部位可以检测到ＯＰN的存在，它主要由ED+巨噬细胞来表达，它参与了梗塞后炎症过程[１7]。OPN主要通过βl和 β 3整合素受体以及CD44受体对巨噬细胞的粘附和迁移发挥调理作用，白介素-1（IL-l）、肿瘤坏死因子（TNF）－ɑ和PDGF能够通过活化PKC而激活OPN的转录。动脉粥样硬化时病灶处多种细胞可以表达OPN，OPN经凝血酶酶切以后，其N-末端片断能够与巨噬细胞表面的CD44受体结合，对巨噬细胞具有趋化功能：而其C-末端片断则可与细胞表面的整合素受体avβ１相互作用介导巨噬细胞的粘附和迁移[１８]。Chiba[１9]等把OPN转基因小鼠分成两组，分别给予高脂饮食和标准饮食3个月，用野生型小鼠作对照，也分成两组作相同的处理。结果标准饮食的小鼠没有发生动脉粥样硬化，而高脂饮食的小鼠动脉粥样硬化的发生率较高，且转基因小鼠动脉粥样硬化斑块明显比野生型小鼠的要大。同对照组相比，转基因小鼠动脉粥样硬化斑块中活化的巨噬细胞表达大量的OPN，斑块中检测到的OPN是来自于原位的巨噬细胞而不是来自于血清。说明高脂饮食条件下，表达OPN的巨噬细胞易被激活，激活的巨噬细胞可以表达OPN促进血液中更多的单核细胞向病灶处迁移，转化成巨噬细胞，从而促进AS的发展。

　　4.3  OPN促进外膜成纤维细胞向内膜迁移

　　AS纤维斑块病变阶段主要特征是病灶处内膜增生，形成纤维结缔组织。近年来外膜成纤维细胞对新生内膜形成的影响受到了极大的关注。研究发现在血管损伤时，外膜成纤维细胞表型发生改变，转化成肌成纤维细胞，后者可向管腔方向迁移，并增殖形成新生内膜。Li等[１1]研究发现FGFl可以通过与其受体FGFR-l结合，诱导OPN表达从而介导成纤维细胞发生迁移。体外培养的大鼠血管外膜成纤维细胞在基础状态下表达一定水平的OPN  mRNA，在TGF β１诱导下，其OPNmRNA转录水平显著增高，外膜成纤维细胞转染OPN反义核酸后，细胞迁移实验发现迁移的细胞数明显低于单纯TGF  β１刺激组，而OPN正义、错配义组无此变化[２０]，说明OPN对外膜成纤维细胞的迁移起趋化作用。内膜损伤后可以释放多种生长因子，如TGF βl可使外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，后者使OPN表达升高并迁移至内膜后分泌OPN，使得更多的MF迁移至内膜，参与新内膜的形成。

　　5  结  语

　　目前OPN参与动脉粥样硬化的发生已经得到许多实验的证实，整合素受体aVβ3阻断剂和OPN中和抗体的使用可以减少新生内膜形成，但OPN参与动脉粥样硬化的具体机制还有待于深入研究。随着对OPN及其抑制剂的进一步研究，相信可以给动脉粥样硬化的预防和临床治疗提供新的措施。

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