核因子-κB反义RNA对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

作者：洪华山，胡榕，洪华山，许昌声，吴可贵    作者单位：1.福建医科大学附属协和医院心内科，福建 福州 350001；2.福建省高血压研究所     【摘要】  目的：探讨核因子（NF）-κB反义RNA重组腺病毒预处理对凝血酶诱导培养的自发性高血压大鼠（SHR）血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的影响。方法：分别用表达NF-κB反义RNA的50多重感染（MOI）重组腺病毒和100μmol/L吡咯烷二硫代氨基甲酸（PDTC，NF-κB特异性阻断剂)预处理VSMCs 48h和1h，采用WST-1试剂和氚胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入率测定0.5U/ml凝血酶诱导的VSMCs细胞增殖率。 结果：与PDTC一样，表达NF-κB反义RNA的重组腺病毒预处理明显抑制凝血酶诱导VSMCs的增殖（P<0.01），抑制率＞30％。结论：NF-κB反义RNA与NF-κB特异性阻断剂对VSMC的增殖具有相同的抑制作用，其抑制率超过30％。

    【关键词】  NF-κB；核糖核酸类，反义；肌细胞，平滑肌

    Effect of antisense RNA of NF-κB on proliferation of vascular smooth muscle cells  in spontaneously hypertensive rats/HU Rong，HONG Huashan，XU Changsheng，WU Kegui//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2009,18(2):116

    Abstract：Objective:To investigate the effect of antisense RNA of NF-κB on proliferation of vascular smooth muscle cells（VSMCs） in spontaneously hypertensive rats（SHR） promoted by thrombin.Methods:After pretreated with the 50MOI recombinant adenovirus expressing antisense RNA of NF-κB for 48h and 100μmol/L PDTC （NF-κB special inhibitor）for 1h， VSMCs proliferation induced by 0.5U/ml thrombin was investigated.The proliferation rate of VSMCs was determined with both WST-1 metabolic activity and 3H-TdR incorporation efficiency.Results:The pretreatment of recombinant adenovirus expressing NF-κ B antisense RNA  obviously inhibit VSMCs proliferation induced by thrombin (P<0.01) at the rate of >30%, which was similar to the inhibition of VSMCs proliferation by NF- κ B special inhibitor PDTC with no statistical difference  between two group(P>0.05).Conclusion:The recombinant adenovirus expressing NF-κ B antisense RNA may effectively inhibit VSMCs proliferation induced by thrombin,is similar to the  NF- κB special inhibitor,may be applied to successive basic research and clinical interference treatment.

    Author′s　address：Department of Cardiology，Union Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou，Fujian，350001,China

    Key words：NF-kappa B;Ribonueleases,antisense; Myocytes,smooth muscle

    血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖、向内膜下迁移、分泌细胞外基质等在血管增殖性疾病的发病中起重要作用。体内可以引起细胞增殖的因素很多，各种有丝分裂原可通过不同的信号传导系统产生细胞增殖反应，单纯抑制某种特定的因子并不能完全抑制病灶形成。因此，阻断调节细胞增殖、分化、迁移等最终共同通路的关键基因成为有效防止血管增殖性疾病的研究方向。核因子-κB（NF-κB）是调节细胞基因转录的关键因子之一，调控几十种生长因子、细胞因子、粘附因子、趋化因子等靶基因的表达[1]。因此，许多学者认为调控NF-κB的活性是一个理想的治疗靶点。基因治疗是从基因水平改变细胞的病理状态而达到治愈疾病的目的，具有一次治疗长期有效的优点，克服现有药物疗法的缺点，实现“生理性治疗”[2]。反义RNA是一类能与特异性mRNA互补的小分子质量的、可扩散的DNA转录物，它能够从翻译水平、转录水平和核酸复制水平上高度特异性地抑制靶基因表达。反义核酸技术的意义在于仅干扰靶基因功能，对基因组其它基因的结构无影响，而且方法简便。本研究试图在细胞水平探讨以腺病毒为载体，NF-κB反义核酸治疗对VSMC增殖的影响，为其在整体动物的水平治疗经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后再狭窄和动脉粥样硬化（AS）奠定基础。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料

    实验所用的自发性高血压大鼠（SHR）购自北京维通利华有限公司［二级动物合格证号：SCXK(京)2003-0003］。表达NF-κB反义RNA重组腺病毒载体－pAd/CMV/269和空载体pAd/CMV系本实验室构建保存[3]；凝血酶、吡咯烷二硫氨基甲酸盐（PDTC）（Sigma公司）1；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR，中国原子能科学研究院）；测定细胞活性的WST-1试剂盒（德国Boehringer Mannheim公司）；阳离子脂质体（Lipofectamine）TM 2000转染试剂（Invitrogen公司）。

    1.2  实验方法

    1.2.1  VSMCs的培养与鉴定[4]:以组织贴块法培养VSMCs。取清洁级三月龄雄性SHR大鼠，无菌操作分离其胸主动脉，剪碎后加入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液（含100 kU/L青霉素，100mg/L链霉素），5%CO2、37℃二氧化碳培养箱静置培养。实验选用3～5代细胞。用光镜和免疫细胞化学法鉴定。

    1.2.2  重组腺病毒的制备、滴度测定及鉴定[3]:PacI酶切使重组腺病毒质粒pAd/CMV/269线性化，紫外分光光度计测定质粒的纯度及浓度。按LipofectamineTM 2000转染试剂盒操作说明，用脂质法转染培养好的293单层细胞，进行细胞内包装，形成并释放完整的腺病毒颗粒。包装后的腺病毒用空斑法测定滴度，操作按ViraPowerTM Adenoviral Expression System 试剂盒说明书。重组腺病毒用聚合酶链式反应（PCR）方法进行验证，按DNA提取试剂盒操作说明。

    1.2.3  实验分组:实验选用3-5代的培养VSMCs，用0.125％胰酶消化后，以2×104个/孔或5×103个/孔，均匀接种于24孔或96孔培养板上，待细胞贴壁生长至70%～80％汇合时，吸弃原培养液，换用无血清或0.2％血清的DMEM培养液，继续培养24h，使VSMCs处于G0/G1期，再进行后续干预实验。将培养细胞分为5组：①空白对照组：加入无血清DMEM液；②空载体组：加入50多重感染（MOI） Ad/CMV感染VSMCs；③凝血酶组：加入终浓度为0.5U/ml凝血酶；④PDTC组：先加入终浓度为100μmol/L的PDTC预处理1h，再加入终浓度为0.5U/ml凝血酶；⑤反义RNA预处理组：先加入50MOI 重组Ad/CMV/269感染VSMCs后48h，再加入终浓度为0.5U/ml凝血酶。按实验要求细胞继续培养至加刺激因素凝血酶后24h，测定细胞增殖率。每组复3孔取均值。重复4次。

    1.2.4  VSMCs增殖的测定方法:WST-1代谢活性测定[4]：取3～5代VSMCs以5×103个/孔均匀接种于96孔培养板上，培养至70%～80％汇合时，换用0.2％血清的DMEM培养液，继续培养24h，使VSMCs处于G0/G1期。在上述各干预因素刺激至规定时间后加入即用型WST-1溶液，10μl/孔，继续置37℃ 5％CO2培养箱孵育90 min。取出培养板，置振荡器上充分振荡（300 r/min）1min，在酶标仪450/630nm双波长处检测光密度（OD）值，即WST-1检测值。每次实验均设一个（复3孔）空白对照孔（以DMEM培养液代替细胞），对照孔吸光值应<0.01。DNA合成率测定：3～5代VSMCs以2×104个/孔，均匀接种于24孔培养板上，在上述干预因素加入时，同时加入1微居里/ml的3H-TdR，共育至相应时间后，吸弃培养液，0.125％胰酶消化细胞，收集细胞于0.45μm的微孔滤膜（预先用10％三氯醋酸湿润）上，负压抽滤，用生理盐水和10％三氯醋酸冲洗滤膜，室温凉干后置入液体闪烁杯中，加入3ml闪烁液［二甲苯+0.5%二苯基噁唑（ppo）+0.04%对苯撑苯唑基（popop）］，静置过夜后，在液体闪烁计数器上进行放射性强度的测定。

    1.3  统计学处理

    实验结果用数据和图表表示，测定值以均数±标准差(±s)。采用SPSS 10.0统计软件包分析。组间比较采用多样本均数的单因素方差分析检验。P<0.05为差异有显著性。

    2  结  果

    2.1  NF-κB反义RNA重组腺病毒感染VSMCs对VSMC WST-1代谢活性的影响

    凝血酶＋反义RNA组和凝血酶＋PDTC组的WST-1的OD值均比凝血酶组明显减少（P<0.01），反义RNA组与PDTC组之间不存在显著差异（P>0.05）。50MOI NF-κB反义RNA和100μmol/L PDTC对0.5U/ml凝血酶诱导的VSMC WST-1代谢活性增加的抑制率分别为35.64％和36.32％，较之凝血酶组显著减少（P<0.01），见表1，图1。

    2.2  NF-κB反义RNA重组腺病毒感染VSMCs对VSMC 3H-TdR掺入率的影响

    凝血酶＋反义RNA组和凝血酶＋PDTC组的3H-TdR掺入率均比凝血酶组明显减少（P<0.01），反义RNA组与DPTC组之间不存在显著差异（P>0.05）。50MOI NF-κB反义RNA和100μmol/L PDTC对0.5U/ml凝血酶诱导VSMC 3H-TdR掺入率增加的抑制率分别为45.22％和49.62％，较之凝血酶组显著减少（P<0.01），见表1，图2。表1  不同组WST-1测定的代谢活性和氚胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入率(n=4)

    3  讨  论

    许多能够抑制VSMC增殖的药物，无论是在基础研究还是临床实验中，均已被证明具有防治动脉硬化及PCI术后再狭窄的作用。但由于药物治疗的效果尚不十分理想，以及必须坚持长期用药给病人心理上造成了巨大的困扰，寻找更加有效和方便可靠的治疗方法便成为心血管病研究的热点。尽管基因治疗目前尚不十分成熟，但在这一领域中所取得的成就已引起众多学者的关注。

    凝血酶是一种重要的血管活性物质，除凝血作用外，晚近也证明它还能促进VSMC的增殖和迁移；促进血管壁非细胞成分的累积和新生内膜形成和释放炎症反应因子等作用，其功能多由细胞表面的凝血酶受体基因介导[5]。NF-κB是调节细胞基因转录的关键因子之一，新近研究发现VSMC中存在着NF-κB通路，且是VSMC增殖必经的激活通路。本系列实验的先前研究结果显示凝血酶能够激活VSMC的NF-κB，使其从细胞浆转位至细胞核，而且凝血酶引起的VSMC增殖与NF-κB途径相关联[6]。NF-κB可能是VSMC增殖的细胞内信号转导的共同通路。国内、外已有利用反义核酸技术抑制凝血酶受体表达来阻断凝血酶作用，从而抑制VSMC增殖的报道[7～9]，但利用反义表达载体、反义核酸技术抑制NF-κB的生成，从而达到抑制凝血酶诱导VSMC增殖的目的至今尚未见相关报道。

    本研究利用前文[3]构建的NF-κB反义RNA腺病毒表达载体，转染293细胞，获得高滴度腺病毒上清，再感染VSMC，观察NF-κB反义RNA对凝血酶引起的细胞增殖的作用。结果显示，该载体能在VSMC内表达出NF-κB反义RNA，显著抑制了凝血酶诱导的VSMC增殖，显示出该反义表达载体在心血管细胞增殖性疾病的基因治疗的研究中具有良好的适用性。

    基因治疗是从根本上针对发病环节的一种治疗手段，靶向性更明显，具有一次治疗长期有效的优点。本实验结果证实，在同等条件下，NF-κB反义RNA对VSMC增殖的抑制率＞30％，即具有生物学效应，且与NF-κB特异性阻断剂PDTC的抑制作用相仿，为今后进一步的基础研究和临床干预治疗奠定了基础。值得注意的是，NF-κB在维持机体的防御功能和细胞生死平衡方面，起着极其重要的作用，完全地、持续地阻断NF-κB激活有可能导致免疫缺陷和正常细胞的凋亡[10,11]。因此，如何进一步提高反义核酸技术的稳定性、有效性、安全性，尚待进一步的研究。

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