缺血后处理对大鼠缺血/再灌注心肌髓过氧化物酶及细胞间粘附分子的影响

作者：刘胜辉，霍玉娥，尹博英    作者单位：河北大学附属医院心内科，河北 保定市 071000 【摘要】  目的：研究缺血后处理对大鼠缺血/再灌注心肌髓过氧化物酶（MPO）及可溶性细胞间粘附分子（sICAM）的影响。方法：选择健康SD大鼠48只，随机分为3组：假手术组、缺血再灌注组（对照组）和缺血后处理组，每组16只。制备大鼠心肌缺血再灌注模型。缺血再灌注组,收紧结扎线缺血40 min, 放松结扎线再灌注240 min；缺血后处理组,缺血40 min后, 再灌注10 s,缺血10 s,连续3个循环，然后再灌注240 min；假手术组，开胸后穿线做套环，但不收紧结扎线。再灌注结束后检测血清肌酸激酶（CK）活性、sICAM含量及心肌MPO活性。结果：①血清CK活性：试验后缺血后处理组和缺血再灌注组（对照组）的CK活性明显高于假手术组[分别为（736.28±21.72），（987.62±28.58），（256.34±19.34）U/L，P<0.01], 缺血后处理组的明显低于对照组(P<0.01)。②心肌MPO活性：缺血后处理组和对照组的均显著高于假手术组（P<0.01），缺血后处理组的较对照组显著降低［（0.86±0.08）U/G∶（1.28±0.26）U/G，P<0.01］。③血清sICAM含量：缺血后处理组和对照组血清的sICAM含量均显著高于假手术组（P<0.01）。缺血后处理组的较对照组显著降低［（54.28±11.69）ng/ml∶（76.62±13.45）ng/ml，P<0.01］。结论：缺血后处理可减轻缺血再灌注损伤，其机制可能与减轻氧化损伤、抑制白细胞的粘附有关。

【关键词】  心肌再灌注损伤；细胞粘附分子；过氧化物酶

　Effect of postconditioning on MPO and sICAM in rats with myocardial ischemia reperfusion/LIU Shenghui, HUO Yue, YIN Boying//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2009,18(2):107

    Abstract：Objective:To study the effect of postconditioning on MPO and sICAM in rats with myocardial ischemia reperfusion.Methods: Totally 48 rats were randomly divided into three groups: Control group (n =16):In anesthetized openchest rats, the left anterior descending (LAD) coronary artery  was occluded for 40 min and reperfused for 4 h,no intervention for reperfusion; Ischemic postconditioning (IP) group (n = 16): after LAD occlusion 40 min, three cycles of 10 s reperfusion  followed by 10 s LAD reocclusion were applied during the first minute of reperfusion,then  reperfused for 4 h; Sham group (n=16):the surgical procedure was identical to other groups, but the LAD ligature was not ligated. The serum creatine kinase(CK),myeloperoxidase (MPO) activity and sICAM content  were measured.Results:Serum CK activity in IP group was  lower than that in control group［（736.28±21.72）U/L,（987.62±28.58）U/L，P<0.01］. Both the MPO activity and  sICAM content were lower in IP group than those in control group［（0.86±0.08）U/g∶（1.28±0.26）U/g，（54.28±11.69）ng/ml∶（76.62±13.45）ng/ml respectively,P<0.01］.Conclusion:IP has protective effect on injury induced by I/R in rats. It has the effect decreasing MPO activity and ameliorating neutrophil adhesion and infiltration.

    Author′s　address：Department of Cardiology,Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding,Hebei,071000,China

    Key words：Myocardial reperfusion injury;Cell adhesion molecule;Peroxidase

    缺血后处理是指心肌发生缺血后，开始再灌注前进行数次短暂再灌注/缺血的循环，它是近年提出的一种新的减轻再灌注损伤的方法。研究表明缺血后处理可以缩小心肌梗死面积，减少再灌注心律失常，具有心肌保护作用[1～3]。粘附分子是介导中性粒细胞与血管内皮细胞粘附的分子基础，髓过氧化物酶（MPO）的活性可以反应心肌组织中中性粒细胞的浸润程度。本研究旨在探讨在体情况下观察缺血后处理对大鼠缺血再灌注心肌MPO及可溶性细胞间粘附分子（sICAM）的影响。

    1  资料与方法

    1.1  实验动物

    健康清洁级SD大鼠48只，雄性，体质量(250±30)g,由北京大学医学部实验动物中心提供。

    1.2  动物模型制备及分组

    1.2.1  动物模型制备：实验大鼠以30 g/L戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉, 仰卧固定于鼠台，行气管切开,用呼吸机进行机械通气,通气频率60次/min, 潮气量20～30 ml/kg，取左胸第3肋间进胸，暴露心脏,于左心耳根部下方1 mm处进针, 5～0 丝线(结扎线) 穿过心肌表层在肺动脉圆锥处稍下方穿线，线两端各穿一小缝合垫片后再并线一起经内径约2 mm的聚乙烯管中穿出，用血管钳推压小管压迫左冠状动脉前降支造成缺血，放松即可恢复血流形成再灌注，收紧结扎线心电图出现ST段抬高, 放松结扎线ST段下降1/2 以上为模型成功。

    1.2.2  动物分组：随机分为3组：①假手术组，开胸后穿线做套环，但不收紧结扎线；②缺血再灌注组（对照组）,收紧结扎线缺血40 min, 放松结扎线再灌注240 min；③缺血后处理组(IP组）,缺血40 min后, 再灌注10 s,缺血10 s,连续3个循环，然后再灌注240 min。

    1.3  检测指标

    1.3.1  肌酸激酶（CK）、sICAM的检测：再灌注结束后自右颈动脉分别采血2 ml, 3 000 r/ min离心10 min, -70 ℃冰箱保存待测。采用7180型全自动生化分析仪（日本日立公司）检测CK 的含量，参照试剂盒（北京中山生物技术有限公司）说明书操作；采用双抗体夹心ELISA法测定sICAM，参照试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）说明书操作。

    1.3.2  心肌MPO活性检测：实验完毕后取缺血区心肌制备成组织匀浆， 4℃离心30min,取上清液-70℃冰箱保存，按MPO试剂盒(购于南京建成生物公司)说明操作,在460 nm处测对照管和实验管的光密度值[D ( 460 )]，计算MPO 活力。MPO活性以37℃的反应体系中H2O2被分解1μmol为1个酶活力单位。

    1.4  统计学分析

    采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，计量数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，P< 0.05为差异有显著性。

    2  结  果 

    再灌注结束后缺血后处理组和缺血再灌注组CK 、sICAM及心肌MPO活性明显高于假手术组, 缺血后处理组明显低于缺血再灌注组(P均<0.05)，见表1。表1  各组肌酸激酶（CK）、可溶性细胞间粘附分子（sICAM）及心肌髓过氧化物酶（MPO）活性检测结果（16例）注：与假手术组比较△△P<0.01；与缺血再灌注组比较▲▲P<0.01。

    3  讨  论

    缺血后处理对再灌注心肌的保护作用是2003年赵志清教授首先发现的 [1]，Staat等[3]2005年率先在临床上证实了其心肌保护作用。缺血后处理的保护机制可能与氧自由基的生成减少、内源性活性物质的释放、膜通道功能状态的变化和蛋白激酶的活化有关[1，4～6]。我们先前的研究[7，8]表明缺血后处理具有抑制凋亡、减轻AMI患者再灌注损伤的作用。

    中性粒细胞在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用。大量活化的中性粒细胞聚集在心肌微血管内并侵润到心肌组织中,通过释放炎性物质、氧自由基、蛋白酶等引起心肌损伤[9]。细胞粘附分子介导了中性粒细胞对组织细胞的粘附浸润，ICAM - 1的细胞外部分能被特异性蛋白酶催化裂解，脱落至血液循环中形成可溶性细胞粘附分子，sICAM可间接反映ICAM - 1的表达情况。本研究发现缺血后处理组sICAM活性明显降低，提示缺血后处理抑制细胞粘附分子的表达，减少中性粒细胞对组织细胞的粘附，从而减轻再灌注损伤。

    MPO 是中性粒细胞的特异性酶，能催化产生多种活性氧化物质，导致氧化应激和氧化性组织损伤，其激活程度与中性粒细胞的浸润程度密切相关，其活性的测定可以反映中性粒细胞浸润情况，本研究发现缺血后处理组心肌组织MPO水平明显减低，提示缺血后处理减少了中性粒细胞的浸润。

    缺血后处理可以减轻再灌注损伤，其机制可能与抑制细胞粘附分子的表达，减少中性粒细胞对组织细胞的粘附浸润有关。

【参考文献】[1]Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，85:H579-H588.

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[3]Staat， Rioufol， Piot C，et al. Post conditioning the human heart［J］. Circulation，2005，112:2143-2148.

[4]Kin H, Zatta AJ, Lofye MT, et al. Postconditioning reduces infarct size via adenosine receptor activation by endogenous adenosine［J］. Cardiovascular Res，2005，67: 124-133.

［5］Argaud L, GateauRoesch O, Raisky O, et al. Postconditioning inhibits mitochondrial permeability transition［J］. Circulation, 2005，111:194-197.

[6]Tsang A, Hausenloy DJ, Mocanu MM, et al. Postconditioning: a form of “modified reperfusion” protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway［J］. Circ Res, 2004，95:230-232.

[7]刘胜辉，杨新春，范 谦.缺血后处理对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡的影响［J］.中国组织工程与临床康复，2007，11（8）：1450-1452.

[8]杨新春，刘 宇，王乐丰，等.缺血后适应减轻急性心肌梗死再灌注损伤的临床研究［J］.中国介入心脏病学杂志，2006，14（6）：323-326.

[9]Lefer AM,Camplell B,Skin YK,et al. Simvastatin preserves the ischemia reperfusion myocardium in nomocholesterolemic rat hearts［J］. Circulation，1999，100 (2) :178-184.