血管内皮生长因子与细胞支架复合物修复大鼠股骨缺损

作者：徐成振, 马鹏, 徐晓峰, 李阳, 钱栋    作者单位：江苏大学 1.临床医学院; 2.附属医院骨科，江苏 镇江 212001

 【摘要】  目的： 探讨血管内皮生长因子(VEGF)与骨髓间充质干细胞（MSCs）、纳米晶胶原基骨(nHAC)复合物对大鼠股骨缺损的修复作用。方法： 将20只SD大鼠制成股骨缺损模型后分2组：对照组植入MSCs/nHAC复合物，实验组植入VEGF/MSCs/nHAC复合物。术后第2，4，8周行影像学和组织学观察;术后第8周行新生骨痂环境扫描电镜（ESEM）检查。结果： 术后第2，4，8周实验组与对照组放射学检查评价骨生成差异有统计学意义(P<0.05)。组织学观察发现实验组较对照组能更快更有效地促进大鼠股骨缺损处的骨痂生长。结论： VEGF/MSCs/nHAC支架较MSCs/nHAC支架对骨缺损的修复有更好的效果。

【关键词】  血管内皮生长因子； 骨髓间充质干细胞； 纳米晶胶原基骨； 骨缺损； 环境扫描电镜

 Effect of vascular endothelial growth factor combined with

    cellsscaffold compound for the repair of rat femoral bone defects

    XU Chengzhen1,  MA Peng1,  XU Xiaofeng2,  LI Yang1,  QIAN Dong1

    (1.School of Clinical Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001;  2.Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001，China)

    ［Abstract］  Objective: To evaluate the effect of vascular endothelial growth factor（VEGF）combined with the compound of marrow mesenchymal stem cells(MSCs) and nanohydroxyapatite/collagen(nHAC) bone on the treatment of rat femoral bone defects.Methods： Animal models of femoral bone defect were established in 20 SpragueDawley rats.They were divided into 2 groups randomly: In control group，defect was filled with nHAC/MSCs scaffolds; in experiment group was filled with MSCs/VEGF/nHAC.Imaging and histological observation were made in the  2nd，4th and 8th weeks after operation.Environment scanning electron microscope(ESEM) observation was made in the  8th week after operation. Results： There were significant differences in bone regeneration between control group and experiment group in the  2nd，4th and 8th weeks after operation(P<0.05).Histomorphology observation showed that new osteotylus of experiment group was earlier and more than control group. Conclusion： The bone defect repair ability of tissueengineering bone which constructed with VEGF / MSCs/ nHAC was stronger than MSCs/ nHAC.

    ［Key words］  vascular endothelial growth factor;  marrow mesenchymal stem cells; nanohydroxyapatite/collagen; bone defect; environment scanning electron microscope

    骨缺损的修复仍然是当前临床骨科面临的难题之一。目前常用的手术治疗方式主要有自体骨移植、异体骨移植和人工骨移植等。骨组织工程学的出现，为这一难题提出了新思路，现阶段骨组织工程学的研究主要集中在种子细胞、支架材料和构建方式三个方面。骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells, MSCs）是最有应用前景的种子细胞, 纳米晶胶原基骨(nanohydroxyapatite/collagen， nHAC)也已经作为骨缺损代用人工合成生物支架材料应用于临床，研究表明其复合MSCs后具有体内成骨能力［1］。本实验选用MSCs为种子细胞与nHAC支架培养后复合血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)来构建VEGF/MSCs/nHAC复合体修复大鼠股骨缺损，观察VEGF在骨修复过程中的作用。

    1  材料和方法

    1.1  材  料

    1.1.1  实验动物  SPF（specific pathogen free）级SpragueDawley（SD）大鼠20只,5～6周龄，体质量140～160 g，雌雄不限；4周龄SD大鼠4只（获得MSCs用），体质量60～100 g,由江苏大学动物实验中心提供。

    1.1.2  主要试剂及仪器  nHAC，由清华大学材料系提供；LDMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(Gbico公司)；孔径40 μm细胞筛（英国Amersham Biosciences公司）；5810R低温离心机（德国Eppendorf公司）；光学显微镜（日本Olympus），VEGF（PeproTech公司）。

    1.2  方  法

    1.2.1  SD大鼠MSCs的获得、传代  取健康幼年SD大鼠(80 g左右)，0.3%戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射麻醉。断颈处死，消毒后无菌条件下取双侧股骨，除去骨表面附着的软组织，用含10%胎牛血清的LDMEM浸泡清洗，切除两端骨骺，显露骨髓腔。用LDMEM培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓；轻轻吹打，制成单细胞悬液；1 000 r/min离心20 min，离心后去上清，用完全培养液（含10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β甘油磷酸钠的LDMEM）重悬，移入培养瓶中，用完全培养液培养。所得细胞悬液接种25 ml塑料培养瓶中,置37℃、体积分数5%的CO2、饱和湿度条件下培养。第3天更换培养液。以后每3 d换液1次，去除未贴壁的细胞，待细胞汇合约80%时，用2.5 g/L胰蛋白酶及0.4 g/L乙二胺四乙酸消化，按1∶2传代培养。

    1.2.2  nHAC复合MSCs及VEGF的制备  超净台内使用手术刀片将nHAC（已消毒包装）切割成2 mm×2 mm×2 mm大小，使用前置24孔板中，用含15％FBS的LDMEM培养液浸润24 h。吸净24孔板中的LDMEM，每孔各加100  μl含15％FBS的LDMEM培养液，将培养的第3代大鼠MSCs使用0.25%胰蛋白酶消化后，离心制成细胞悬液，细胞计数板将细胞浓度调整到5×106/ml，吹打均匀，微量移液管吸取100  μl滴到材料nHAC表面，37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内静置培养2 h后，反转材料，向材料另一面滴加100  μl细胞悬液，37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内静置培养2 h后，加LDMEM（含15％FBS）浸没材料，37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内静置培养，每3 d换液1次，复合培养14 d。

    取一半制备好的大小均一的MSCs/nHAC支架与VEGF溶液充分混匀,吸附2 h后，在真空机中抽吸出支架中的气体,使VEGF充分吸入支架（每只鼠植入支架约含VEGF 0.8 μg）分别密封于双层聚乙烯薄膜内,γ射线 2.5×105 Gry,照射1 h后,-70℃深低温冷冻干燥24 h,置于4℃冰箱备用。另一半MSCs/nHAC支架不加VEGF按上述方法冻干备用。

    1.2.3  构建骨缺损模型及植入组织工程骨  选取成年SD大鼠20只,每组10只，雌雄不限,称重后用0.3%戊巴比妥钠30～35mg /kg剂量腹腔注射麻醉。麻醉后,取俯卧位,术野处剪毛消毒, 取下肢后外侧切口,显露股骨,用手术剪造成股骨中段0.5 cm的骨缺损模型(包括骨膜)。对照组植入MSCs/nHAC支架，实验组植入VEGF/MSCs/nHAC支架。术后肌注青霉素8万单位,连注3 d,不做内外固定，常规颗粒饲料饲养。术中严格无菌操作，所有骨缺损模型均由同一组人员完成，骨缺损长度、截骨位置均相同。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

    1.3  观察指标

    1.3.1  一般情况  术后观察动物的进食、活动和切口愈合等一般情况。

    1.3.2  大体观察  术后第2，4，8周每组各随机处死1只大鼠切取股骨标本，编号，剥离附着肌肉等软组织，行大体观察了解骨缺损修复情况，注意缺损区是否完全为新骨修复，新骨与断端连接情况以及塑形良好与否。

    1.3.3  X线检查  分别于术后第2，4，8周随机选取2只大鼠摄术侧股骨正侧位X线片, 以了解骨缺损的修复情况，并根据参考文献［2］评分标准进行放射学评分评估。

    1.3.4  病理组织HE切片  术后第2，4，8周随机选取2只大鼠，处死后剔除股骨软组织，行HE染色观察骨痂生长情况。

    1.3.5  骨密度测量  术后第2，4，8周随机选取3只大鼠，处死后剔除股骨软组织，CHALLENGE双能量X射线骨密度仪上测量骨缺损区的骨密度，每个标本所选定的测量区的位置、面积均相同，所测值为相对值。

    1.3.6  环境扫描电镜（ESEM）观察  术后第8周每组随机选取1只大鼠处死后剔除软组织，新生骨痂处做ESEM观察新生骨小梁情况。

    1.4  统计学处理

    实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS11.5统计软件中的两独立样本间的t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  术后一般情况

    各组大鼠术后3 h清醒，术侧肢体活动欠佳，约7 d伤口一期愈合，均无炎症反应，对照组有2只活动受限，实验组1周后均活动自如。

    2.2  大体观察结果

    术后第2周：两组移植物与宿主界线尚清，对照组稳定性较差,有明显异常活动，实验组局部可见少量纤维状骨痂。术后第4周：植入物与宿主界线不清，对照组仍有少许活动，实验组骨痂较多,推之不动。术后第8周：对照组骨痂少量，2例有异常活动，实验组有大量骨痂生成。

    2.3  X线检查结果及放射学评分

    对照组术后第2，4周骨缺损处未见明显的骨痂形成；术后第8周可见少量云雾状新生骨痂。实验组术后第2周骨缺损处略见骨痂形成，影像呈薄云雾状；术后第4周缺损区两端可见明显的新生骨痂；术后第8周整个缺损区均可见新生骨痂，形成骨缺损区的桥接。放射学评分结果见表1。表1  两组术后骨缺损区放射学评分

    2.4  植入支架后骨缺损修复情况

    对照组（图1）：术后第2周，组织内可见充血水肿、大量的淋巴细胞与中性粒细胞浸润等明显的炎性反应现象，植入材料中的MSCs还未向成骨细胞转化，仍呈成纤维样细胞；术后第4周，炎性反应明显减轻,可见少量类骨质形成；术后第8周，出现少量的骨样组织，大部分仍为纤维组织。实验组（图2）：术后第2周，组织内可见中性粒细胞与淋巴细胞浸润等炎性反应现象， MSCs也未向成骨细胞转化；术后第4周，植入物内nHAC部分降解，空隙内可见大量的成骨细胞，并有类骨质生成；术后第8周，可见大量的编织骨样组织。

    2.5  骨密度测量结果

    对照组与实验组在术后第2，4，8周骨密度比较，差异有统计学意义，P<0.05。见表2。表2  两组术后骨密度测量结果

    2.6  电镜观察结果

    对照组术后第8周骨小梁排列不规则，可见骨陷窝结构；实验组术后第8周骨痂形成明显，可见大量骨小梁结构和成骨细胞,见图3。

    3  讨  论

    MSCs来源广泛且在体外可大量扩增,在不同的诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞等多种细胞［3］，是目前骨组织工程最常用也是最重要的种子细胞。MSCs具有理想的骨组织工程种子细胞应具有的特点：取材容易,对机体的损伤小；体外扩增能力强；易定向分化为成骨细胞；植入体内后能很好地适应受区生理、病理和应力环境并保持成骨活性。Arinzen 等［4］在实验中植入同种异体MSCs治疗骨缺损, 在任何时间点均未检测到抗宿主反应, 组织学上无淋巴细胞浸润, 未检测到抗同种异体细胞抗体，说明MSCs不会引起机体的免疫排斥反应。田志逢等［5］用MSCs复合异种骨基质明胶修复大鼠桡骨缺损发现骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体有较强的成骨能力。

    理想的支架材料必须具有良好的生物降解性和生物相容性、适宜的表面亲水－疏水平衡、较强的细胞特异性识别能力以及一定的机械强度［6］。俞兴等［7］将纳米羟基磷灰石 /胶原骨修复材料应用于颈椎前路植骨融合手术中,其效果接近自体骨移植。沈铁城等［8］将nHAC应用于临床，证实其效果接近自体骨移植，认为nHAC是一种理想的骨修复材料。孙伟等［9］采用nHAC和MSCs复合来修复兔股骨头坏死缺损，证明nHAC复合异体MSCs后有较强的传导成骨作用,能促进骨缺损的愈合。

    VEGF是一种血管内皮细胞特殊的促细胞分裂剂及血管生成诱导剂,能特异性地作用于内皮细胞,促进其增殖和血管形成,被认为与骨再生和血管化有关。Street等［10］用可溶性VEGF受体对骨折修复过程中的鼠股骨骨折模型进行处理,并与单纯骨折动物模型的对照组进行比较,证实了VEGF能增加组织中碱性磷酸酶表达，表明VEGF是普通骨折的愈合修复所必需的。

    本实验在以上研究的基础上用异体MSCs与nHAC共培养制成MSCs/nHAC支架复合物，并复合VEGF构建组织工程骨，通过放射学、组织学及骨密度测定来评价其成骨能力。结果显示：本支架复合物植入大鼠体内后无排斥反应及炎症反应，且VEGF/MSCs/nHAC复合物成骨更快，较MSCs/nHAC复合物具有更好的骨再生能力，其成骨方式主要为软骨内成骨。推测VEGF的作用为：促进了局部微血管的形成和成骨细胞的分化、增殖从而加快了软骨内成骨的速率，缩短了骨修复时间,提高了骨再生的质量和速率。

    但要想临床应用仍有许多问题需要解决，如支架的强度、种子细胞和细胞因子的复合方式、VEGF的可控缓释方法等。本课题证实了VEGF对骨形成的促进作用，为进一步深入研究组织工程骨提供了实验依据。

【参考文献】  ［1］ Zhu JZ, Miao ZN, Qian HG.Bone formation performance by autograft of rabbit mesenchymal stem cells cocultured with nano basal hydroxyapatite materials ［J］.Chinese Journal of Clinical Rehabilitation, 2006, 10(41):195-197.

［2］ Bos GD, Goldberg VM, Powell AE, et al.The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts ［J］.J Bone Joint Surg Am, 1983, 65(1):89-96.

［3］ Yang F, Williams CG, Wang DA, et al.The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells ［J］.Biomaterials, 2005, 26(30):5991-5998.

［4］ Arinzen TL, Peter SJ, Archambault MP, et al.Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a criticalsized canine segmental defect ［J］.Bone Joint Surg Am, 2003, 85(10): 1927-1935.

［5］ 田志逢，秦书俭，王瑞芳，等.骨髓间充质干细胞复合异种骨基质明胶修复大鼠桡骨缺损［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(15):2801-2805.

［6］ Yang F, Williams CG, Wang DA, et al.The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells ［J］.Biomaterials, 2005, 26(30):5991-5998.

［7］ 俞 兴,崔福斋.骨移植替代材料在脊柱外科中的应用［J］.生物骨科材料与临床研究,2004, 1(3): 52-54.

［8］ 沈铁城，黄永辉，徐晓峰，等.纳米晶胶原基骨材料在临床上的应用［J］.医学研究杂志，2006，35（4）：70－73.

［9］ 孙 伟,李子荣,史 振.纳米晶胶原基骨和骨髓间充质干细胞复合修复兔股骨头坏死缺损的研究［J］.中国修复重建外科杂志,2005,19(9): 703-706.

［10］ Street J, Bao M， deGuzman L， et al.Vascular endothelial growth factor stimulates bone repair by promoting angiogenesis and bone turnover ［J］.Proc Natl Sci USA, 2002, 99(15): 9656-9661