甲泼尼龙对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠SRp30c的影响

作者                                    作者单位

危智盛                        广东药学院,临床医学院,广东,广州,510080

王晓辉                        广东药学院,临床医学院,广东,广州,510080

洪铭范                        广东药学院,临床医学院,广东,广州,510080

苏全喜                        广东药学院,临床医学院,广东,广州,510080

余青云                        广东药学院,临床医学院,广东,广州,510080

臧林泉                        广东药学院,临床医学院,广东,广州,510080

潘雪刁                        广东药学院,临床医学院,广东,广州,510080

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种常见的中枢神经系统白质脱髓鞘病变，临床对于MS急性发作和复发常首选甲泼尼龙(methylprednisolone，MP)冲击治疗。然而，MP使用的剂量一直存在争议，现常用的有500，1 000，2 000 mg/d。超大剂量能否提高疗效及有无诱导糖皮质激素(glucocorticoid，GC)抵抗，引起临床关注。糖皮质激素抵抗(glucocorticoid resistant)发生机制非常复杂，其中剪接因子家族中SRp30c与激素抵抗密切相关[1，2]。本研究通过对实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)大鼠模型MP治疗后神经组织中SRp30c mRNA表达情况进行分析，探讨MP治疗作用及MS发生激素抵抗的可能机制。

广东药学院学报 第25卷 第3期 危智盛，等.甲泼尼龙对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠SRp30c的影响1 材料与方法

1.1 实验材料

Wistar雌性大鼠，体质量180～200 g;豚鼠，体质量350～400 g，均购自南方医科大学实验动物中心(许可证号：Scxk粤20060015);不完全弗氏佐剂购自Sigma公司;卡介苗冻干粉、百日咳菌液购自中国药品生物制品检定所;总RNA提取试剂Trizol Reagent(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Toyobo公司);甲泼尼龙(Pfizer Manufacturing Belgium NV公司)。

1.2 EAE模型制备[3]

以豚鼠全脊髓制成无黏性50%(V∶V)髓鞘碱性蛋白(MBP)生理盐水匀浆。将卡介苗冻干粉与不完全弗氏佐剂混匀，配成卡介苗浓度为4 mg/mL的完全弗氏佐剂。再将MBP匀浆与等体积的完全福氏佐剂混合，反复抽打成油包水样，制成抗原乳剂。戊巴比妥钠腹腔麻醉Wistar大鼠后在大鼠四肢足垫分别注入抗原乳剂共0.4 mL，并在大鼠左后肢足背皮下注射0.1 mL百日咳菌液(约含3×109个菌体)。免疫接种后每天观察大鼠反应、进食、体质量、行动等情况。依据Kono[4]标准对神经损害症状进行评估：正常或无任何神经缺损症状，记0分;I级：尾部肌张力消失，可见轻度步态笨拙，记1分;Ⅱ级：尾部无力，双后肢肌张力低，记2分;Ⅲ级：尾部无力，双后肢瘫痪，但给予刺激后可挪动，记3分;IV级：瘫痪累及前肢，伴尿便失禁，记4分;V级：濒死状态或死亡，记5分。症状介于两标准级之间以±0.5分记。

1.3 实验分组及给药

EAE发病大鼠随机分成3组，分别为：①大剂量组8只，予MP 100 mg/kg;②小剂量组8只，予MP 25 mg/kg;③模型对照组7只，予等容量生理盐水;另取5只未经造模的Wistar大鼠同等条件下饲养作为正常对照组，予等容量生理盐水。造模后第12天，大鼠发病达高峰时开始给药。MP以生理盐水稀释后自尾静脉缓慢注入，每日给药1次，连续3 d后均减半量再给药2 d，共给药5次。

1.4 组织取材

各组给药5 d后，于第6天进行评分后处死，取大鼠部分新鲜脊髓组织置液氮保存，备作总RNA提取。另取大脑视交叉层面2 mm脑组织、小脑、脑干、脊髓颈膨大、腰膨大部分4%多聚甲醛固定做常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察脑、脊髓组织的形态学变化。

1.5 RTPCR

新鲜脊髓组织研磨制成Trizol匀浆，异硫氰酸胍苯酚氯仿一步法提取总RNA,紫外分光光度法测定RNA的量和纯度。cDNA合成及PCR扩增反应体系均按试剂盒说明进行。引物由Invitrogen公司合成，SRp30c引物序列：sense:5′TTCTAA ACACAGTGGGCGACTC3′,antisense:5′TACGTAATT TCGACCAGAGCCA3′, 产物199 bp; 内参 G3PDH序列：sense:5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′,antisense:5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，产物450 bp。PCR产物与loading buffer混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪观察后成像，Qantity one凝胶图像分析系统测定SRp30c及G3PDH的吸光度，计算SRp30c/G3PDH值，作为SRp30c mRNA的表达水平。

1.6 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行分析，首先对数据做正态性检验，计量资料以±s表示。若符合正态分布，两组间用t检验;多组间参数比较采用单因素方差分析;多组均数两两比较采用LSDt检验分析;相关关系采用Pearson相关分析。

2 结 果

2.1 EAE大鼠发病情况

免疫诱导后，大鼠于第10天始先后发病，表现为体质量进行性下降、尾巴张力减退，继之尾巴无力，并发展为后肢及四肢无力、麻痹、大小便失禁。Kono评分1分以上即为发病。EAE大鼠脑、脊髓组织HE染色光镜下可见小血管充血、管壁增厚、内皮细胞有破坏、血管周围大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，并在小血管周围形成典型的“袖套样(cuffing)”改变。而正常对照组大鼠脑和脊髓均未见异常。

2.2 各组大鼠治疗前后评价

大剂量组及小剂量组EAE大鼠经MP治疗后神经损害表现明显改善，而模型对照组大鼠症状无改善。治疗组Kono评分总体下降，而模型组评分增高(图1)。大剂量组与小剂量组给药前后评分改变的差值差异无显著性(P>0.05)。见表1。

2.3 SRp30c mRNA表达结果

各组大鼠脊髓组织均可检测到SRp30c mRNA表达，见表2，图2。大剂量组与小剂量组SRp30c mRNA表达差异无显著性(P>0.05);模型对照组与正常对照组间差异无显著性(P>0.05);而大剂量组、小剂量组SRp30c mRNA表达高于模型对照组、正常对照组，差异有显著(P<0.01或P<0.05)表1 EAE大鼠给药前后Kono评分情况与治疗前比较：▲P<0.01，*P<0.05;与模型对照组比较：#P<0.01表2 各组大鼠SRp30c mRNA的表达

2.4 SRp30c mRNA表达与神经损害评分改善相关性分析

经MP治疗后的大鼠症状评分均有不同程度的改善，对大鼠治疗前后Kono评分改善的差值与其SRp30c mRNA表达值进行相关性分析，r=-0.583，P<0.05，见图3，两者呈负相关，表明SRp30c mRNA的表达值越高，疗效越低。

3 讨 论

EAE病理改变和临床表现与MS极为相似，是国内外公认的研究人类MS发病机制及实验治疗的最适宜模型[5]。糖皮质激素可以通过诱导T细胞凋亡及下调T细胞黏附分子等机制达到治疗EAE的作用[6]。构建Wistar大鼠EAE模型，并予不同剂量MP治疗，大鼠神经损害表现明显得到改善，治疗后Kono评分降低;而模型对照组病情无改善，Kono评分升高。证明糖皮质激素治疗EAE能达到缓解症状，缩短病程的作用。通过比较大剂量组和小剂量组各大鼠评分改善的程度，得出两组间差异无显著性，因此还不足以说明增大MP剂量能提高疗效。本实验样本量不够大，另外大鼠对药物剂量的耐受范围大等因素可能影响结果的评价。是否疗效与剂量存在一定关系还有待继续探讨。

GC是MS急性发作和复发治疗的主要药物，大剂量静脉MP冲击治疗与大剂量强的松口服治疗均能达到类似的疗效[7]。然而大剂量GC的使用，可诱导患者对激素的敏感性下降，甚至出现GC抵抗的可能。而GC抵抗机制非常复杂，在不同的疾病、不同的病人中其发生机制也不尽相同。目前，国内外已有大量研究表明糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)的2种亚型：GRα及GRβ，其比例失常与GC抵抗关系密切。GRα表达量的减少或GRβ表达量的增多，或者两者同时发生变化，均会导致GRα/GRβ比例的改变，高比例与GC敏感有关，而低比例则常发生GC抵抗[8]。GRβ是在GR前体mRNA的选择性剪接过程中形成的。剪接因子SRp30c是富含丝氨酸/精氨酸蛋白家族(serine/argininerich protein，SRP)成员之一，其在促进GR premRNA发生选择性剪接形成GRβ mRNA的过程中发挥着重要作用。Xu[9]等研究表明SRp30c与中性粒细胞中的GRβ表达水平密切相关。杨昊[1]、李居一[2]等对激素抵抗型和激素敏感型哮喘、系统性红斑狼疮、肾病综合征等患者的PBMC中SRp30c mRNA的表达进行研究，进一步证实了其与GRβ以及GC抵抗之间的关系。目前，国内外尚未见MS患者或EAE模型中SRp30c与激素抵抗关系的相关报道。

通过对各组脊髓组织SRp30c mRNA半定量分析发现，未使用MP的模型组与正常对照组之间SRp30c mRNA表达无差异，说明SRp30c mRNA表达与病情无关。而使用过MP的大剂量组和小剂量组SRp30c mRNA表达均高于模型对照组和正常对照组。推断SRp30c mRNA表达在一定程度的增高预示着皮质激素治疗后有发生GC抵抗的可能。研究发现，治疗组各大鼠Kono评分改善的差值与其SRp30c mRNA表达呈负相关，提示SRp30c mRNA表达与MP疗效呈负相关，进一步证明其与GC敏感性下降有着密切的关系。EAE模型发生GC抵抗的机制中SRp30c可能扮演着重要的角色，推断SRp30c也与MS患者发生激素抵抗有着密切的关系。

【参考文献】

[1] 杨昊，刘荣玉. 糖皮质激素敏感型与抵抗型患者GRα、GRβ及SRp30c mRNA表达水平[J].中华内科杂志，2006,45(3):223-224.

[2] 李居一，徐建华. 糖皮质激素受体α,β 和剪接因子SRp30c在系统性红斑狼疮的表达及意义[J].中华风湿病学杂志，2007,11(5):262-266.

[3] 徐玉，刘瑞春，王颖，等. Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立[J]. 脑与神经疾病杂志，2007，15(6):415-417.

[4] KONO DH,URBAN JL,HORVATH SJ,et al. Two minor determinants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice[J]. J Exp Med,1988,168(1):213-227.

[5] PETRY KG,BOULLERNE AI,POUSSET F,et al. Experimental allergic encephalomyelitis animal models for analyzing features of multiple sclerosis[J]. Pathol Biol (Paris),2000,48(1):47-53.

[6] WüST S,VAN DEN BRANDT J,Tischner D,et al. Peripheral T cells are the therapeutic targets of glucocorticoids in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Immunol,2008,180(12):8434-8443.

[7] THROWER BW. Relapse management in multiple sclerosis.[J]. Neurologist，2009，15(1):1-5.

[8] LEWISTUFFIN LJ,Cidlowski JA. The physiology of human glucocorticoid receptor beta(hGR beta) and glucocorticoid resistance[J]. Ann N Y Acad Sci,2006,1069:1-9.

[9] XU Q,LEUNG DY,KISICH KO. Serineargininerich protein p30 directs alternative splicing of glucocorticoid receptor premRNA to glucocorticoid receptor beta in neutrophils[J]. J Biol Chem,2003,278(29):27112-27118.