抗病毒治疗慢性丙型肝炎患者T细胞表面程序性死亡1和程序性死亡配体1的表达

程序性死亡1(programmed death-1，PD-1)是CD28家族共刺激分子，通过招募磷酸化酶SHP-1和SHP-2，抑制下游信号转导，进而抑制T淋巴细胞(T细胞)功能[}1}a PD-1是细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)耗竭的标志。慢性丙型肝炎(CHC)患者外周血和肝细胞内的HCV特异性CTLs的PD-1均表达上调，另外，体外阻断PD-1和其配体的相互作用，可以显著提高HCV特异性CTLs的效应功能，甚至在CD4-T细胞缺乏的个体中也可以发生[}Z-sy CHC患者经聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗，外周血PD-1及其配体(programmed death-ligand 1,PD-L1)在T细胞的表达变化的研究较少。我们对24例抗病毒治疗的CHC患者动态观察24周PD-1及PD-L1在T细胞的表达以及与HCV RNA和ALT的关系并以此推测CHC患者治疗后免疫应答的恢复情况。

资料与方法

一、一般资料CHC患者均来自南京市第二医院2008年10月至2011年10月的门诊和住院的患者，共24例，男14例，女10例，年龄19一69岁，基因1b型HCV感染19例，2a型4例，1b+2a型1例，诊断均符合2004年《丙型肝炎防治指南》[4]。患者均排除其他病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病等，同时在人组前6个月未经过任何抗病毒治疗。均接受聚乙二醇干扰素a-2a(Peg-IFN二一2a，瑞士罗氏公司生产)每周皮下注射一次，不能耐受者改为135，联合利巴韦林800一1200 mg/d，治疗24一48周，分1b或lb+2a型治疗48周，2a型治疗24周，治疗4周检测HCV RNA仍阳性者延长疗程至48周。疗效判断:4周时病毒载量达到检测下限500拷贝/ml以下为4周HCV RNA阴性组(简称阴性组)，未达到检测下限为4周HCV RNA阳性组(简称阳性组);12周病毒载量达到检测下限为完全早期病毒学应答(complete early virological response,cEVR)，HCV RNA无下降或者下降小于2 1g为无病毒学应答(no virological response,NVR)，治疗结束随访24周病毒载量小于检测下限为持续病毒学应答(Sustained virologic response,SVR)，高于检测下限为复发。

二、主要试剂和仪器异硫氰酸荧光素(FITC)标记小鼠抗人单克隆抗体CD4,藻红蛋白一菩类染料5(PE-Cy5)标记的小鼠抗人单克隆抗体CD8}PE标记的小鼠抗人单克隆抗体PD-1和PD-L 1及同型对照抗体IgG 1购自美国eBioscience公司;红细胞裂解液购自美国B&D公司;HCV RNA荧光定量PCR检测试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司;流式细胞仪购自美国BD公司;Light Cycle荧光定量PCR仪购自德国罗氏公司;全自动生物化学分析仪购自美国雅培公司。

三、实验方法

1.流式细胞仪分析T细胞PD-1和PD-L 1的表达:准备三个试管，一试管加鼠抗人抗体FITC-CD4,PE-Cy5-CD8和PE-IgG 1各10}1，一试管加FITC-CD4,PE-Cy5-CD8和PE-PD-1各10}u 1，另一试管加FITC-CD4,PE-Cy5-CD8和PE-PD-L 1各10}1，各加100}1 EDTA抗凝全血，4 0C避光孵育30 min;加10倍稀释后红细胞裂解液1 ml裂解红细胞，磷酸盐缓冲液洗涤2次后，立即上流式细胞仪检测。

2.HCV RNA定量检测:用核酸提取柱提取HCV RNA，然后取12.5}u I加入PCR反应液，PCR反应液配比:PCR主反应液:酶混合物:荧光探针为7:5:0.5,PCR反应体系:50 0C,25 min;94 0C，2 min;94 0C，lOs;55℃，15s;72 0C，15s;5个循环;94 0C，lOs;60℃，45 s;42个循环。严格按实时荧光定量PCR试剂盒说明书操作。3.肝功能检测:血浆ALT由我院生物化学实验室检测，ALT>40 U/L为异常。

四、统计学方法统计分析采用SPSS16.0软件。计量结果以均数士标准差标士s)表示。两样本计量结果分析采用t检验，治疗前后的计量结果采用重复测量的单因素或两因素方差分析，所有检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、阴性组和阳性组患者治疗前后HCV RNA,ALT检测结果24例CHC患者根据4周病毒检测结果分成两组，4周HCV RNA阴性组19例和阳性组5例。HCV RNA阴性组，HCV基因1b型感染者15例，2a型3例，1b+2a型1例，4周HCV RNA已位于检测下限;阳性组HCV基因1b型感染者4例，2a型1例，4周HCV RNA仍为阳性，但12周后均位于检测下限。治疗前两组患者的HCV RNA检测结果，t二0.442,P=0.663，差异无统计学意义，阳性组患者4周检测HCV RNA与治疗前比较，病毒载量明显下降，F=18.811,P=0.012，差异有统计学意义。两组患者的ALT在治疗前比较，t=0.213,P=0.834，差异无统计学意义。阴性组患者治疗4,12,24周与治疗前比较，ALT水平明显下降，F值分别为9.453,11.081和9.725,P值均<0.01;阳J胜组患者治疗4,12,24周与治疗前比较，ALT水平无明显下降，F值分别为0.721,2.149和2.125,P值均>0.05，差异无统计学意义，见表1。

二、阴性组和阳性组患者治疗前后PD-1和PD-L1表达水平的变化1.CD4+T细胞表面PD-1的表达:CD4+T细胞表面PD-1的表达阴性组和阳性组组间比较，差异无统计学意义。两组患者治疗4,12,24周与治疗前比较，PD-1的表达明显下降，F值分别为5.368,7.388和10.923,P<0.05和P<0.01。阴性组:治疗24周与治疗前比较检测结果明显下降，F=12.406,P=0.002;阳性组:PD-1的表达各个治疗时间点与治疗前比较，差异无统计学意义，见表2,30 2.CD8+T细胞表面PD-1的表达:CD8十T细胞表面PD-1的表达阴性组和阳性组组间比较，差异无统计学意义，两组患者治疗4,12^24周与治疗前比较，差异无统计学意义。阴性组患者治疗24周与治疗前比较明显下降，F=4.955,P二0.039;阳性组患者各个治疗时间点检测结果与治疗前比较，差异无统计学意义，见表2,30 3.CD4十T细胞表面PD-L1的表达:CD4+T细胞表面PD-L1的表达阴性组和阳性组组间比较，差异无统计学意义。两组患者治疗4,12,24周与治疗前比较，差异无统计学意义;阴性组患者PD-L1的表达各个治疗时间点与治疗前比较，差异无统计学统计学意义;阳性组患者PD-L1的表达各个治疗时间点与治疗前比较，差异无统计学意义(表2}3)0 4.CD8+T细胞表面PD-L1的表达:CD8十T细胞表面PD-L 1的表达阴性组和阳性组组间比较，差异无统计学意义，两组患者治疗4周与治疗前比较，F=3.455,P=0.076，差异无统计学意义;治疗12,24周与治疗前比较PD-L 1的表达明显升高，F值分别为7.410和13.904,P<0.05和P G O.Olo阴性组患者治疗4,12,24周与治疗前比较明显升高，F值分别为9.063 8.365和9.736,P值为0.008,0.010和0.006;阳性组患者治疗24周与治疗前比较明显升高，F=10.292,P=0.033。见表2,30

三、SVR组和复发组患者CD4+和CD81T细胞表面PD-1和PD-L1的表达水平的变化达到SVR患者共20例，阴性组中18例，阳性组2例，HCV基因1b型感染者16例，2a型3例，1b+2a型1例。阴性组1例和阳性组3例复发，其中HCV基因1b型感染者3例，2a型1例。1.SVR组和复发组患者CD4`T细胞表面PD-1的表达:SVR组和复发组CD4十T细胞表面PD-1的表达组间比较，F=0.260,P>0.05，差异无统计学意义。两组患者治疗4,12周与治疗前比较，F值分别为1.208和1.707,P>0.05，差异无统计学意义;治疗24周与治疗前比较明显下降，F=5.569,P=0.028;SVR组在治疗4,12,24周与治疗前比较明显下降，F值分别为6.133,5.541和14.780,P<0.05或P<0.01，差异均有统计学意义。复发组各时间点与治疗前比较，差异无统计学意义，见表3，4a 2.SVR组和复发组患者CD8+T细胞表面PD-1的表达:SVR组和复发组CD8十T细胞表面PD-1的表达组间比较，F=0.097,P=0.758，差异无统计学意义。两组患者治疗4,12,24周与治疗前比较，F值分别为0.672,0.780和3.463,P值均>0.05,差异无统计学意义。SVR组在治疗12,24周与治疗前比较明显下降，F值分别为4.964和4.613,P值均<0.05，差异均有统计学意义。复发组各治疗时间点与治疗前比较，差异无统计学意义，见表3,4a 3.SVR组和复发组患者CD4TT细胞表面PD-L 1的表达:SVR组和复发组CD旷T细胞表面PD-L1的表达组间比较，F=2.131,P=0.158,差异无统计学意义。两组患者治疗4周与治疗前比较明显升高，F=4.972,P=0.037,12,24周与治疗前比较，F值分别为2.161和2.114,P值均>0.05，差异无统计学意义。阴性组患者PD-L 1的表达各个治疗时间点与治疗前比较，差异无统计学意义;阳性组患者PD-L1的表达各个治疗时间点与治疗前比较，差异无统计学意义。见表3,40 4.SVR组和复发组患者CD8十T细胞表面PD-L1的表达:SVR组和复发组CD8-T细胞表面PD-L1的表达组间比较，F=1.426,P=0.2450,差异无统计学意义。

两组患者治疗4,12,24周与治疗前比较明显升高，F=5.963,7.319和8.410,P<0.05或P<0.01，差异有统计学意义。SVR组在治疗12,24周与治疗前比较明显升高，F值为6.442和12.349,P<0.05和P<0.01，差异有统计学意义。复发组治疗各时间点与治疗前比较，差异无统计学意义，见表3,40讨论T细胞表面存在免疫抑制和免疫激活分子，两者对维持机体免疫耐受和免疫活化之间的平衡起重要作用。免疫抑制分子PD-1与其配体PD-L 1，两者的相互作用能显著抑制T细胞免疫功能[n]。急性HCV感染早期，患者外周血HCV特异性CD旷和CD8+T细胞PD-1高水平表达，自发清除HCV，经过干扰素联合利巴韦林抗HCV治疗有效的患者，PD-1表达明显下降[[5-6]。而进展为CHC者，则表现为HCV特异性CD8+T细胞PD-1持续高表达并且肝脏内PD-1在总CD4‘和CD8+T细胞以及HCV特异性CD4+和CD8+T细胞的表达水平明显高于外周血。我们之前发现CHC患者外周血总CD4+和CD8+T细胞上PD-1和PD-L 1表达水平明显高于健康对照组o

 PD-L 1在髓系树突细胞上的同样高表达，体外用PD-L 1单克隆抗体阻断PD-1 PD-L 1途径可以恢复病毒特异性CDBTT细胞的免疫功能;这在慢性HCV,HBV和H工V感染者中均可检测到。我们对24例CHC患者进行了72周的随访研究，并且动态检测前24周T细胞表面PD-1和PD-L 1表达。研究显示，治疗4周时，无论HCV RNA有无转阴，T细胞上PD-1和PD-L 1的表达水平差异均无统计学意义，其明显的变化主要体现在时间上，如CD4-T细胞表面PD-1的表达在治疗4,12周和24周时均明显下降，CD8+T细胞表面PD-L1的表达在治疗12周和24周时均明显升高。

SVR和复发组，两组T细胞上PD-1和PD-L 1的表达水平均无明显差异，两组患者CD4十T细胞表面PD-1的表达在治疗24周时明显下降，CD4+T细胞表面PD-L1的表达在治疗4周时明显升高，CD8+T细胞表面PD-L 1的表达在治疗4,12周和24周时均明显升高。由于两组数据的样本数相差较大，所以我们对每一组组内进行了比较，发现治疗4周HCV RNA阴性组CD旷T和CD8十T细胞表面PD-1的表达在治疗24周较治疗前明显下降，而CD8+T细胞表面PD-L I的表达在各治疗时间点较治疗前明显升高;SVR组也发现CD4+T细胞表面PD-1的表达在各治疗时间点较治疗前明显下降，CD8+T细胞表面PD-L 1的表达在治疗12,24周较治疗前明显升高;而治疗4周HCV RNA阳性组和复发组各治疗时间点与治疗前比较变化不大。推测，快速有效的抗病毒治疗可以下调CHC患者外周血CD4十T和CD8十T细胞表面PD-1的表达，上调CD8}T细胞表面PD-L 1的表达，两者有望成为预测抗病毒的疗效以及临床转归的新指标。经过抗HCV治疗后，患者HCV RNA明显下降，肝功能明显好转，提示患者的细胞免疫得到加强。免疫抑制受体PD-1表达下降也是细胞免疫提高的体现，而其配体PD-L I在治疗后反而提高，故PD-L I起抑制免疫的作用受到质疑，其可能在一定程度上起到免疫激活的作用，这与Urbaru等[6j研究结果相似，其研究显示，经过IFN一二联合利巴韦林治疗急性丙型肝炎3一6个月，ALT和HCV RNA明显下降，树突细胞表面PD-L 1的表达上升。本次研究我们所用CHC患者数量较少，对T细胞上PD-1和PD-L 1的检测没有延长到72周。如果能获得较大样本和长时间的研究，更有可能对PD-1和PD-L 1作为预测抗病毒的疗效以及临床转归的新指标进行量化。

参考文献

[1]Chen L.Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control ofT-cell immunity[J].Nature Reviews Immunology,2004.336-347.

[2]Urbani S,Amadei B,Tola D.PD-1 expression in acute hepatitis C virus(HCV)infection is associated with HCV-specific CD8 exhaustion[J].Journal of Virology,2006,(22):11398-11403.doi:10.1128/JVI.01177-06.

[3]Golden-Mason L,Palmer B,Klarquist J.Upregulation of PD-1 expression on circulating and intrahepatic hepatitis C virus-specific CD8+T cells associated with reversible immune dysfunction[J].Journal of Virology,2007.9249-9258.

[4]中华医学会肝病学分会,中华医学会传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志,2004,(4):194-198.

[5]Kasprowicz V,Schulze Zur Wiesch J,Kuntzen T.High level of PD-1 expression on hepatitis C virus(HCV)-specific CD8+and CD4+T cells during acute HCV infection,irrespective of clinical outcome[J].Journal of Virology,2008.3154-3160.

[6]Urbani S,Amadei B,Tola D.Restoration of HCV-specific T cell functions by PD-1/PD-L1 blockade in HCV infection:effect of viremia levels and antiviral treatment[J].Journal of Hepatology,2008.548-558.

[7]Radziewicz H,Ibegbu CC,Fernandez ML.Liver-infiltrating lymphocytes in chronic human hepatitis C virus infection display an exhausted phenotype with high levels of PD-1 and low levels of CD127 expression[J].Journal of Virology,2007.2545-2553.

[8]蔡仁田,沈玲,张永臣.慢性丙型肝炎患者免疫细胞PD-L1表达特点及临床意义[J].江苏医药,2009,(12):1392-1394.

[9]蔡仁田,沈玲,张永臣.慢性丙型肝炎患者T细胞PD-1表达特点及临床意义[J].南京大学学报(自然科学版),2009.602-606.

[10]Penna A,Pilli M,Zerbini A.Dysfunction and functional restoration of HCV-specific CD8 responses in chronic hepatitis C virus infection[J].Hepatology,2007.588-601.