重型乙型肝炎患者T细胞受体BV CDR3家族表达水平分析

　　重型乙型肝炎(fulminanthepatitisB,FHB)是由HBV感染后导致的肝脏功能衰竭，发病机制复杂，一般认为与机体细胞免疫有关。而T淋巴细胞受体(T-cellreceptor,TCR)在T细胞发挥免疫作用过程起着关键作用。分析TCR日链可变区(betachainvariable,BV)基因谱系的选择性表达可了解免疫系统的识别状态，是日益受到高度重视的研究领域。本研究采用RT-PCR方法扩增FHB患者与健康人群TCRBV的互补决定区(complementaritydeterminingregion3,CDR3)基因24个家族，通过对各家族扩增产物定量分析比较，以期了解T淋巴细胞免疫应答在FHB发病机制中的作用，现报道如下。　　1对象与方法　　1.1研究对象选择我科2010年10月至2012年3月住院的重型乙型肝炎患者28例(男性23，女性5)，年龄18}65岁之间，平均年龄为35.8士10.6岁;健康对照组20例(男性16，女性4)，年龄在(29一48)岁之间，平均年龄为(32.6±4.8)岁。　　FHB诊断标准参照中国2006年《肝衰竭诊疗指南》。人组标准:年龄16一70岁;HBVDNA阳性;无核昔类似物和(或)干扰素抗病毒治疗史;排除标准:合并其他嗜肝病毒感染;合并自身免疫性、酒精性、药物性、脂肪性等其他因素引起的肝损害;合并严重细菌、真菌感染;妊娠或哺乳期妇女;肿瘤患者;合并其他严重的全身性疾病和精神病患者;既往或近期使用免疫抑制剂治疗。　　1.2标本采集与检测　　1.2.1 RNA的抽提及cDNA的合成:用肝素抗凝管采集10ml外周静脉血，分离外周血单个核细胞(PBMC)，用Trizol法提取总RNA，取1},gRNA在逆转录酶(百泰克公司)及Olig(dTl8)引物作用下，在总体积为50闪体系中合成cDNA，具体操作按说明书进行。　　1.2.2 RT-PCR方法检测:根据文献[5」设计合成TCRBV24个家族引物，并在(}链恒定基因区(BC)设计一条共用的下游引物及对照引物(上海生工生物工程有限公司合成),PCR反应体积为50闪，其中含10x扩增缓冲液5.0N,l,TaqDN_Polvmerase1.011,1,10mol/LmdNTP1.0N,l，上、下游引物(10}.i,mol/L)各1.0},t,l,cDNA模板1.0},1,ddHzO5.0闪。反应条件:反应体系经94℃预变性3min后进入循环，每次循环为94}C60s,500C60s,720C60、，共35个循环，然后为720}C,10min延伸。PCR结束后，取PCR产物7闪在1.5%琼脂糖电泳凝胶上电泳，以标准DNA相对分子质量为标准，余一20℃保存备用。　　1.2.3实时定量荧光PCR反应:反应体系25闪，2xSYBRMix12.5N,1，TaqDNAPolymerase0.15浏，ddHZ09.4闪，上游引物分别用各家族特异性引物(10N.,mol/L)1.0},1，下游引物共用引物(10N,mol/L)1.0N.,l，乙肝cDNA2N.,l。反应条件为940C预变性2min;940C10s,600C30s,40个循环。荧光信号采集设在600C。　　由此步骤可得出一个Ct值，C代表CYCLE,T代表threshold即荧光域值，其含义为:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数;此外由对照组那对引物得到的Ct值为TCR值，通过Ct值减去TCR值得到的△Ct值，可排除模板差异对Ct值的影响，能间接反映出每个样本TCRBV各家族含量的差异。　　1.3统计学方法应用SPSS12.0软件进行统计分析。计量资料用无士、表示，组间均数比较用t检验，P<0.O5表示差异有统计学意义。　　2结果　　2.1临床转归FHB患者25例完成随访，根据疗效分为治愈好转组(早期4例，中期6例，晚期1例)和无效死亡组(早期0例，中期6例，晚期8例)，病死率为60.71%。　　2.2FHB组与健康对照组TCRBVCDR3家族RT-PCR扩增产物定量分析比较FHB组△Ctl,OCtl2,OCt20的含量高于健康对照组，OCtS,OCt7,OCt13,pCti4,OCt15,}Ct22,}Ct23的含量低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1.　　3讨论　　我国是乙型肝炎高发区，每年约有1%的乙型肝炎患者发生重型肝炎，常规内科治疗病死率极高，严重影响了国民的身体健康及经济发展。已有的研究显示，与乙型重型肝炎发生可能相关的多种因素，均须通过调节T细胞免疫应答，特别是导致由特异性CTL介导的免疫应答失调而与重型肝炎发生关系。　　TCR是T淋巴细胞表面的抗原受体，参与抗原的特异性识别，在T细胞免疫应答中起着决定性作用。TCR由。和a链或，和s链构成异源性二聚体，外周血中TCRa日T淋巴细胞占9s%，其胞外区结构有可变区(variableregion,V)和恒定区(constantregion,C。其可变区由三个互补决定区(CDR)和间隔的四个骨架区构成。其中CDR3区是与抗原表位结合的主要位点，不同的T淋巴细胞克隆具有特定的CDR3区。CDR3区的长度和序列决定其结构，从而决定TCR的特异性。　　目前，应用于TCRCDR3指纹分析的方法主要包括基因序列分析和表型分析两大类。其中较常用的是根据人类TCRBV24个基因家族的cDNA序列特点设计24条特异性上游引物，从共同区设计一个BC下游引物(荧光标记)，进行每个家族的PCR扩增，从而了解T淋巴细胞的功能。张光文等人〔5〕应用RT-PCR结合Genescan，对慢性HBV感染不同临床类型的患者TCRCDR3谱系进行了初步分析，发现CHB患者均有部分家族呈现单/寡克隆增生谱型，部分家族呈现多克隆背景上的优势峰，但又不同于正态分布的谱型。董霄等7一人研究发现CHB患者T细胞受体可变区p7表达低下与T细胞免疫功能障碍密切相关。　　本研究借助该项技术对本院的28例FHB患者与20例健康体检者进行了TCRBVCDR3各家族扩增产物定量分析，结果显示:FHB组Ctl,Ct12,Ct20的含量高于健康人群组，而Ct5}Ct7,Ct13,Ct14,Ct15,Ct22,Ct23的含量低于健康对照组，经统计学分析，差异有统计学意义(P<0.05)，表明FHB患者TCRB.'CDR3区部分家族表达水平出现异常，提示T淋巴细胞功能与肝脏炎症病变的发生存在着紧密的关系。由此说明T细胞对抗原刺激的应答是复杂的，这一点可能是FHB患者免疫异常研究的切人点，以此为切人点的深层次研究将可能丰富并推动FHB免疫损伤机制的研究，同时也将为HBV所致FHB免疫功能异常，继而导致病情恶化提供了一条新的治疗思路。　　4参考文献　　Cohn M. On a key postulate of T-cell receptor restrictive function:the V-gene loci act as a single pool encoding recognition of the polymorphic alleles of the species major histocompatibility complex[J].{H}IMMUNOLOGY,2007.140.　　Nishimura Y,Miura Y,Maeda M. Expression of the T cell receptor V beta repertoire in a human T cell resistant to asbestosinduced apoptosis and peripheral blood T cells from patients with silica and asbestos-related diseases[J].Int J Immunopathol Phaharmacol,2006.795-805.　　Matsutani T,Ohmori T,Ogata M. Comparison of CDR3 length among thymocyte subpopulations:Impacts of MHC and BV segment on the CDR3 shortening[J].{H}Molecular Immunology,2007.2378-2387.　　中华医学会感染病学会分会肝衰竭与人工肝学组,中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组. 肝衰竭诊疗指南[J].{H}中华肝脏病杂志,2006.643-646.　　张光文,姚新生,马世武. 慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞受体潜系分析及互补决定区3序列测定[J].{H}中华肝脏病杂志,2006,(1):23-28.doi:10.3760/j.issn:1007-3418.2006.01.007.　　Schuurhuis DH,loan FA,Nagelkerken B. Antigenantibody immune complexes empower dendritic cell to efficiently prime specific CD8 + CTL responses in vivo[J].{H}Journal of Immunology,2002.2240-2246.　　董霄,林佑武,张诗军. 慢性乙型肝炎湿证患者外周血TCRVβ亚家族谱系表达及意义探讨[J].{H}中国实验方剂学杂志,2010,(10):186-189.doi:10.3969/j.issn.1005-9903.2010.10.059.