乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭患者乙型肝炎病毒前C/C区联合突变特点分析

乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭（HBV一acute onchronic liver failure，HBV一ACLF）是指在HBV感染基础上出现的急性肝功能失代偿。临床上病情危重、病死率高。病毒学机制是影响疾病结局的重要因素之一。近年来有关HBV突变与慢加急性肝衰竭（ACLF）之间关系的研究较多，但结果差异较大。由于之前的研究多是通过HBV一ACLF患者与慢性乙型肝炎（CHB患者之间的横向研究，因此认为如能对HBV慢性感染后不同疾病阶段的患者进行综合比较，则可进一步说明HBV突变与ACLF之间的关系。鉴于此，选取HBV慢性感染后处于疾病不同阶段的患者作为本试验研究对象，对比不同患者之间HBV前C/C区联合突变数量与联合突变率的差异，进一步明确ACLF患者HBV突变特点。

1材料与方法

1.1研究对象选取2002年1月一2009年7月于解放军第三0二医院住院诊治的慢性HBV感染者166名。其中，ACLF 49人，CHB 45人，肝硬化（LC ）45人，肝细胞癌（HCC）27人。所有患者均住院治疗，经病史及化验检查明确为感染HBV 6个月以上，排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒重叠感染，排除合并巨细胞病毒、EB病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染；排除合并自身免疫性肝炎、脂肪肝以及酒精性肝病。肝衰竭诊断符合2006年我国《肝衰竭诊疗指南》},-,制订的标准。CHB及LC诊断标准符合2000年《病毒性肝炎防治方案》}‘一的标准。HCC以肝C叭MRI或肝动脉造影检查为标准。人选患者一般资料详见表to1.2实验室检查及HBV DNA定量患者人院后常规进行肝功能、’肾功能一、血常规、乙型肝炎抗原抗体5项，即HBV标志物（HBV M） ,HBV DNA定量及分型。上述检查由三O二医院检验科完成。HBV M经酶联免疫（Ke-wei Diagnostic Ltd.北京）或化学发光法（Abbott Laborato-ries, Chicago, IL, USA）检测，HBV DNA水平由荧光定量PCR法检测，检测值下限为100 U/Lo1.3  HBV前C/C区PC R扩增

1.3.1提取HBV DNA应用QiAamp DNA BloodMini Kit试剂盒从200闪血清中提取HBV DNA。按试剂盒说明书进行操作。1.3.2  HBV前C/C区PCR扩增采取巢式PCR法扩增HBV前C/C基因片断。如第一轮PCR结果阳性（电泳条带清晰、均一），则不再进行第二轮PCR;如第一轮PCR结果弱阳性或阴性，则进行第二轮PCR扩增。设计引物如下「，一：外引物P1（上游引物）：5' -TCGCATGGAGACCACCGTGA一3’（1604一1623 nt）；外引物P2（下游引物）；5‘一ATAGCTTGCCTGAGTGC-- 3' （ 2076一2060 nt）；内引物P3（上游引物）：5' -CATAAGAGGACTCTTGGACT一3‘（1653一1672 nt）；内引物P4（下游引物）；5‘一GGAAAGAAGTCAGAAGGC一3'（1974一1957 nt）。采用罗氏高保真PCR系统。采用50闪反应体系，第一轮PCR取15闪HBV DNA纯化产物作为模板。操作步骤如下：94℃预变性1  min ; 94℃变性15 s,60℃退火30 s,68℃延伸45 s,10个循环；94 0C变性15 s,60℃退火 30 s , 68℃延伸45 s（每个循环增加5 s） ,20个循环；72 0C延伸7 min。第二轮PCR除模板采用第一轮产物1闪外，其余相同。

1.4基因测序及分析PCR产物经电泳鉴定条带清晰、大小正确后（图1），直接送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果用Vector NTI Suite9. 0软件进行比对分析。

1.5统计学方法应用stata 9. 0软件对数据进行分析。正态分布的连续数据用均数士标准差（x士、）表示；非正态连续数据采用中位数（最小值，最大值）表示。多组间均数比较均采用方差分析和kruskal一wallis检验，率的比较采用犷检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1基因型分布和常见前C/C区突变位点16}名患者中，B型HBV感染者28例，C型138例。常见的前C/C区核昔酸突变位点为： 1752 （ A-} G），1753 （ T->C或G）、1762（A-->T） ,1764（GSA）、1766（C}T） ,1768（TEA） ,1773（C->T）、1799（C一G）、1846（ACT） ,1858（T-}C）1896（GSA） ,1899（GSA ）、1913（C-}A或G） ,1915（G-- >A或C）等。

2.2 4组患者联合突变数量分析166例患者中，149例有该区域2个或2个以上的核昔酸位点的突变。对4组患者突变数量进行分析，结果提示CHB组患者中，仅有2个位点突变者比例最高，为40 %（18/45）；ACLF组患者中5联突变和7联突变分别是20.4 % （10/49）和12. 2 % （6/49 ），其中所占比例高于其他3组，6联突变者有7例（14. 3% ），其比例与HCC组相近（4/27 ,14. 8 %），高于其他2组（图2）。

2.3常见联合突变组合形式分析HBV前C/C区核昔酸联合突变常常以固定的组合形式出现。比如常见的nt1762和nt1764联合突变等。对149例有2联突变以上的患者进行归纳整理后发现，某些突变位点经常相伴出现。2联突变中比较常见的联合突变形式是nt1762 +nt1764, nt1846+nt1896，nt1846+nt1913，nt1753+nt1896, nt1896+nt1915, rn1752+nt1799;分别有117例，43例，31例，27例，21例和18例。我们称这些2联突变为“双突变单位”。而3联、4联等多位点联合突变则多是由这些“双突变单位”互相组合形成（表2）

另外，联合突变在4组患者中出现的频率有一定的特点。在ACLF组患者中，nt1846 + nt1896和nt1846 + nt1913 2联突变比例明显高于其他组患者（44 . 9 % , 22/49和42. 9% , 21/49 ）3联突变中nt1762+nt1764+nt1846和ntl 846+ntl 896+nt1913的阳性率也在ACLF组中最高（42. 9% , 21/49和28.6 % , 14/49 ） 0 4联突变、5联突变可见到同样的规律，含ntl $46和nt1913突变的联合突变组合阳性率在ACLF组均为最高。同样，在HCC组患者中，以n t1762 + nt1764为基础的联合突变最为多见。

3讨论ACLF是指在慢性肝病基础上发生的急性肝功能损伤，其机制涉及过度炎症反应、免疫异常等多方面因素「6。在HBV一ACLF发病过程中，病毒学机制是疾病发生发展的重要因素之一。很多学者进行了大量工作，力图阐明病毒学机制在HBV一ACLF中的作用，但各研究结果之间仍有不同意见。例如，Xiao等7研究提示B型HBV G1896A和A1762T/G1764A突变与HBV一ACLF相关，但我们的研究结果‘却显示AI762T/ G1764A与HBV一ACLF之间关系并不密切既往的研究提示，HBV前C区突变可直接影响到病毒复制能力和HBe:4g的表达，与肝衰竭的发生有密切的联系R]。因此，HBV前C区突变也一直是ACLF病毒学机制中研究的热点。定点突变的研究结果显示，前C区突变对病毒复制能力和HBeAg表达的影响具有累积效应。随着突变数量的增加、突变组合形式的不同，其HBV病毒复制能力逐步增强〔9。HBV一ACLF的发生也与突变数量和特定的突变组合形式有密切的联系。为此，作者对166名慢性HBV感染者，其中49名HBV一ACLF患者，进行前C/C突变的检测，分析突变数量、突变组合形式与ACLF之间的关系。

结果发现，HBV一ACLF患者HBV前C/C区多联突变者所占比例普遍高于其他HBV慢性感染者。而其突变的组合也有一定的特点，含ntl 846和 nt1913突变的联合突变组合阳性率在ACLF组均为最高。这说明nt I846和nt1913突变与HBV一ACLF关系更为密切。本组之前对4例HBV一ACLF患者HBV突变纵向观察的结果也得出同样的结论。本文从联合突变的角度进一步证实这种相关性的存在。并且，在分析多联突变模式的特点后，还进一步发现在ACLF患者中，HBV nt1846和nt1913两突变位点多相伴出现，具体机制仍有待进一步明确。 B,C型HBV 1846位核着酸野生型为腺嘿吟脱氧核昔（A），该位点位于HBV}茎环起始位置。A1846T突变有可能通过改变赶茎环的底部结构而影响HBV生物活性。另一方面，A1846及下游的T1847 , 61848共同组成一个开放读码框架（ORF）起始密码子（ATG），而理论上这个ORF可能会抑制核心蛋白的表达。该突变消除了这个起始密码子，从而可能会导致HBV复制能力的增强。1913位突变的生物学意义同样仍不明确，由于该位点变异可引起HBcAg第5位氨基酸的变异（脯氨酸、苏氨酸或丙氨酸）。该氨基酸位于HBcAg HLA II限制性辅助性T细胞抗原表位，故nt1913变异可能会引起该表位的变化，从而影响病情的严重程度。但上述假设仍有待进一步功能性实验来证实。

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