HIV新发感染的实验室检测方法进展

  人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）是艾滋病的病原体，其发病率是衡量HIV流行程度的最重要参数，用以描述艾滋病的流行特征，如识别高危人群、评估干预效果。在HIV感染早期，患者无典型临床症状，难以判断感染时间，造成艾滋病发病率无法准确统计。传统的发病率计算方法通常复杂、成本昂贵、不精确，如通过在HIV阴性人群中开展前瞻性队列研究，所获得的发病率不具有人群代表性，且由于干预措施影响到研究对象的行为改变进而不可避免地影响到监测结果。  鉴于上述方法的局限性，人们开始关注通过实验室检测HIV感染者样本中的标志物来区分是否新发感染，进而计算发病率。本文主要对近年发展起来的HIV新发感染实验室检测方法进行综述。  1 免疫标志物判断  HIV感染时间的血清学方法（serologictestingalgorithms,STARHS）Janssen等[1]于1998年报道了一种用于HIV新发感染检测的血清学方法，即STARHS.STARHS是基于酶联免疫反应原理，利用抗体生成的不同阶段，其数量、比例、亲和力、同种异构体（isotype）或特异性等属性存在差异，精确地从HIV阳性样本中检测出近期感染者。当“近期”被定义为一个准确的时间段后，HIV发病率便可以借助一次横断面调查精确计算出来。遗憾的是，这类方法最初因为在亚型之间差异明显，影响了其在全球范围的推广应用。此外，因为该类方法主要用于监测和研究，在当时缺乏商业前景，因而一度发展受挫。  1.1基于HIV特异性抗体定量检测的BED.捕获酶联试验（BED.captureEIA,BED.CEIA）  1.1.1检测原理为了解决STARHS方法检测HIV亚型时出现的差异问题，美国疾病预防控制中心在20世纪90年代初建立了BED.CEIA.该方法通过检测HIV感染者体内HIV特异性IgG占HIV总抗体的比例来区分是否为近期感染。因为方法设计过程中采用了由HIV.13种亚型（B、E、D）衍生所得的gp41片段，在检测中加入这种片段（肽），就可与酶联板上包被的羊抗人IgG抗体结合，而该抗体可以识别来自广泛范围的HIV.1亚型的gp41片段，因此称为BED.CEIA.HIV感染者在血清阳转后，其体内的HIV特异性IgG抗体与总IgG抗体的比例随HIV感染时间的增加而增高，从感染者的抗体检测呈阳性开始到BED.CEIA的光密度值达到一个设定的临界值（用来区分HIV长期感染与新发感染）为止的这段时间，为STARHS的窗口期。不同的HIV亚型有不同的窗口期，最新的研究结果提示最佳窗口期为155d,其对应的临界值为0.8,检测方法的敏感性和特异性分别达到76.82%和93.48%[2].  1.1.2应用情况BED.CEIA发展至今，已经有商品化试剂，价格低廉、操作简便、性能稳定。但使用一段时间后，人们发现BED.CEIA会将一部分长期感染者错判为近期感染者，导致对HIV发病率的高估[3.4].因此，WHO在2005年曾建议该方法不能用于常规监测[5].此后研究表明，导致错分的原因与患者体内抗体水平下降有关。导致抗体水平下降的原因有接受高效抗逆转录病毒治疗情况、感染者疾病进展情况、天然的低抗体水平，以及免疫反应变异性等。因此，错分率作为校正因子被引入发病率计算公式中。然而BED.CEIA高错分率的问题仍然无法根本解决，这迫使决策者们开始慎重考虑是否使用该方法。尽管面临严峻的挑战，美国疾病预防控制中心仍然坚持将其作为HIV发病率监测评估系统的重要组成部分使用[6].目前，BED.CEIA仍然是迄今应用最广泛的方法。中国于2005年开始将BED法应用到常规哨点监测系统中，现已在全国病例报告系统中广泛应用[7.11].  1.2基于检测成熟HIV特异性抗体占总抗体比例的亲和力试验  1.2.1检测原理抗体亲和力是评价抗体与相应抗原结合能力的指标。其原理为HIV抗体对HIV抗原的亲和力在感染后的一年内会随时间而呈线性增加。标本预先以1mol/L的亚硝基胍和10%的磷酸缓冲液分别处理，成熟抗体的氢键将不被亚硝基胍破坏，其抗原抗体结合反应则不受影响。用Ax.SYMHIV1/2gO试验进行检测，结果以亲和力指数（avidityindex,AI）表示。国外学者研究证明，AI在血清阳转后的前15个月明显升高，此时AI大约为0.9,此后AI增长减缓，直至稳定在1.0左右[12.14].在血清阳转后的前6个月其检测HIV新发感染的特异性非常高。所以当AI取一个合适的值，就能准确地区分新发感染和既往感染。低AI的标本，新发感染的可能性大，AI<0.8时，敏感性和特异性达到最适值，分别为79.4%和92.3%.目前，推荐AI=0.8作为HIV发病率监测的截断值（Cutoff值），与其对应的感染时间估计在8~9个月以内；AI<0.6时，敏感性为26.4%,特异性为98.9%,推荐用于个体新发感染诊断，感染时间估计在130d左右。  1.2.2应用情况亲和力试验有商业化试剂，价格便宜，操作简单并已实现自动化，可重复性好，结果不受抗病毒药物、性别、年龄等因素影响，且对HIVB亚型和非B亚型的检测结果均无差异[13].亲和力试验与BED试验经校准后联合使用，结果与6个月的队列研究所得发病率接近[15].  2 病毒学标志物判断HIV感染时间的杂合子分类法（mixedbaseclassifier,MBC）  目前，HIV发病率研究主要聚焦于建立一种没有病毒亚型差异，错分率更低的新发感染判断方法---一种基于生物信息学原理，以HIV基因遗传分化程度作为感染时间标志以判断其是否为新发感染的方法，即MBC.  2.1检测原理研究证实，大多数的HIV感染者最初感染的都是单一的HIV病毒，感染者体内最初总是单一的病毒群[16].但HIV病毒因其逆转录酶缺乏校正功能，其基因在宿主体内会随着感染时间的延长而发生分化，以至于病毒群不再单一而出现不同准种。在对患者的核酸序列进行分析时，同一个核苷酸位置可能检测到不止一种碱基，这种现象叫做混合碱基/杂合子现象。以人群为基础的混合碱基/杂合子判读能反映准种遗传分化的程度。混合碱基/杂合子占全序列碱基的百分比可以作为评估患者体内基因分化程度的指标。基因分化的速度与时间呈线性关系，在感染的最初8年，混合碱基/杂合子比例以每年0.2%的速度递增，但此后速度会减慢，直至进入平台期[17.19].在已知新发感染者中，混合碱基/杂合子比例在HIV不同亚型之间没有差异。因此，HIV序列的混合碱基/杂合子比例可区分病毒是新发感染还是既往感染，该方法已开始应用于HIV.1B亚型及非B亚型pol区基因的分析。  2.2检测方法通常利用0.5mL左右HIV感染者血清样本进行RNA提取，对蛋白酶区及部分逆转录酶区基因进行反转录和扩增，得到的产物进行序列测定。在对测序结果进行分析时，发现某些核苷酸位点有别于其他位点的单峰，而是出现主次两个峰，见图1,预示这些位点可检测到不同的碱基。次峰与主峰的面积比例通常用τ表示。目前认为τ>15%时，可判读为混合碱基/杂合子，但使用受试者工作特征曲线（ROC曲线）和分析的结果证明，对混合碱基的判读，是否采用同样的阈值不重要，阈值在15%~25%时该方法的性能一样好。  2.3临界值确定不同的临界值对应不同的窗口期。Kouyos等[19]早期的研究中，曾使用ROC分析当特异性与敏感性达到最适值时的临界值。Kouyos等[19]曾建议临界值取0.5%,窗口期取1年，敏感性可达86.8%,特异性可达70%.有学者认为临界值为0.47%时，敏感性和特异性能达到最佳拟合，其对应的窗口期为155d,对应的敏感性和特异性分别为88.8%和74.6%.由于HIV感染早期病毒载量很高，传染性很强，155d作为窗口期，对于研究HIV传播动力学更有意义[20].图1HIV核酸序列混合碱基/杂合子判读示例  2.4方法的影响因素PCR引物、测序方法，以及人工判断时的主观性等技术原因，都是导致结果偏倚的重要因素。使用短的序列进行分析时，因为碱基总数小，偏倚的可能性更大。在MBC中，如果仅依据某一个碱基来判断，则会大大降低MBC的准确性[20].  2.5应用情况目前，BED和MBC最高的吻合率只有68.98%[15].与STARHS一样，MBC也是基于人群水平而非个体水平的新发感染检测方法。该方法是对大量序列进行分析时的副产物，通常是在进行某地区HIV传播性耐药监测的同时获得，可谓一举两得。但因为对实验设备要求高，试剂昂贵，所以在资源有限国家的应用受到限制。目前少有对MBC方法用于新发感染检测的应用研究报道。  3 展望  HIV新发感染的实验室检测可以获得较准确的HIV发病率，对艾滋病的预防控制具有重要意义。STARHS方法技术成熟、操作简便、成本低廉，适合已建立HIV病例报告系统，资源有限国家或地区大范围开展HIV的发病率监测，但检测结果需要流行病学专家审慎解释。MBC方法技术成熟，但操作复杂、成本高，适合于已建立健全的艾滋病治疗及HIV耐药监测体系的国家和地区开展，该方法还可同时获得抗病毒治疗耐药流行的数据，后者有望得到进一步发展和应用。  参考文献  [1]JanssenRS,SattenGA,StramerSL,etal.NewtestingstrategytodetectearlyHIV.1infectionforuseinincidenceestimatesandforclinicalandpreventionpurposes[J].JAMA,1998,280（1）：42.48.  [2]ParekhBS,McdougalJS.ApplicationoflaboratorymethodsforestimationofHIV.1incidence[J].IndianJMedRes,2005,121（4）：510.518.  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