月见草花提取物对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响

作者                                               作者单位

邓丽                         宁夏回族自治区人民医院,银川,750021

王琦                         宁夏医科大学基础医学院病原生物学和免疫学教研室,银川,750004

赵建宁                       宁夏医科大学基础医学院病原生物学和免疫学教研室,银川,750004

王宁萍                       宁夏医科大学基础医学院病原生物学和免疫学教研室,银川,750004

周娅                         宁夏医科大学基础医学院病原生物学和免疫学教研室,银川,750004

月见草(Oenothera biennis L)，又名夜来香，为柳叶菜科月见草属植物。我国自1936年引种后，在黑龙江、吉林、辽宁、江苏、江西和宁夏等分布广泛，做为油药植物大面积栽培[1]。月见草的食药两用性以及美容效果在国际中已有广泛共识，现代医学证明，月见草有卓越的抗炎，抗氧化，抗血栓，降血脂，抗肿瘤，保护神经细胞[2]，缓解经前症候群[3]，减肥及抗衰老等作用[4]。本文旨在观察月见草花两种提取物对环磷酰胺免疫抑制小鼠细胞免疫的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 ICR小鼠，8周龄，体重18～22g，雌雄各半，由宁夏医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 实验试剂和仪器 月见草花为宁夏产月见草的干花(购于宁夏荣康月见草种植基地)，乙酸乙酯(Ethylacetate，EAc)提取物是经乙醇提取后再用乙酸乙酯提取的浸膏，每克浸膏生药含量为148g;水提取物采用煎煮法制备浸膏，每克浸膏生药含量为23g。环磷酰胺(Cyclophosphamide，Cy)为江苏恒瑞医药股份有限公司产品。绵羊红细胞、豚鼠血清(宁夏医科大学实验动物中心提供)，小鼠TNF-α、IFN-γ检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司提供)，ConA、MTT、RPMI-1640培养基(Sigma公司产品)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及给药方法 ICR小鼠80只，随机分为8组，每组10只，雌雄各半。第1组为正常对照组：每日用生理盐水20mL/kg灌胃1次，共8d;第2组为模型组：每日用生理盐水灌胃1次，于第5天腹腔注射Cy 50mg/kg;第3、4、5组为月见草花乙酸乙酯提取物组：分别按低剂量437.5mg/kg、中剂量875mg/kg和高剂量1750mg/kg每天灌胃1次，持续8d，并于第5天腹腔注射Cy 50mg/kg;第6、7、8组为月见草花水提取物组：分别按低剂量437.5mg/kg、中剂量875mg/kg和高剂量1750mg/kg每天灌胃1次，持续8d，并于第5天腹腔注射Cy 50mg/kg。第9天测定各项免疫学指标。

1.2.2 脾脏T淋巴细胞增殖能力的测定[5] 无菌取脾，置于盛有Hank's液的平皿中研磨过滤，除去结缔组织、裂解红细胞，经培养液重悬后进行计数。将脾细胞浓度配成5×106/mL，加有丝分裂原ConA于96孔培养板进行培养，同时设不加ConA的对照孔，孵育68h。每孔加入10μL MTT作用4h，加细胞裂解液，在490nm波长处用酶标仪测定光密度OD值。增殖反应以ConA刺激指数SI表示，按下式计算：SI=实验组平均OD值/对照组平均OD值。

1.2.3 细胞因子的分泌水平测定 小鼠眼眶放血于Eppendorf管，将所取的小鼠血液于室温静置一段时间，分离血清后离心，-20℃保存待测。小鼠TNF-α、IFN-γ的检测按照试剂盒的说明进行操作，通过测定450nm波长处的OD值经标准浓度曲线计算出细胞因子浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 12.0 软件，实验数据以(±s)表示，采用单因素方差分析进行组间差异的比较。

2 结果

2.1 小鼠免疫抑制模型制备

与正常对照组比较，模型组小鼠脾淋巴细胞ConA刺激指数SI值和细胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌水平均明显降低(P<0.05)，表明小鼠免疫抑制模型制备成功，见表1。

2.2 月见草花提取物对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

与模型组比较，月见草花乙酸乙酯提取物中剂量组和水提取物中剂量组的ConA刺激指数SI值显著增高(P<0.05)。中剂量乙酸乙酯提取物组与中剂量水提取物组比较，月见草花提取物对Cy所致小鼠T脾淋巴细胞增殖功能降低的恢复作用较好(P<0.05)，见表1。表1 月见草花提取物对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响

2.3 月见草花提取物对免疫抑制小鼠细胞因子分泌水平的影响(表1)

与模型组比较，月见草花中剂量乙酸乙酯提取物可明显提高免疫抑制小鼠血清细胞因子TNF-α和IFN-γ分泌水平(P<0.05);中剂量水提取物组小鼠血清TNF-α的分泌水平也明显升高(P<0.05)。中剂量乙酸乙酯提取物组与中剂量水提取物组比较，免疫抑制小鼠血清TNF-α的升高幅度较大(P<0.05)。

3 讨论

细胞免疫是T淋巴细胞介导的一种重要免疫反应，是机体抵抗细胞内微生物如病毒和宿主细胞内增生细菌感染的防御机制。淋巴细胞转化试验是测定机体细胞免疫功能的重要指标。本文结果显示，两种月见草花提取物中剂量组的小鼠脾脏T淋巴细胞ConA刺激指数SI值与模型组比较均有不同程度的增高，表明月见草花两种提取物能够促进ConA诱导的免疫抑制小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖，提示两种提取物对免疫抑制小鼠的细胞免疫功能有增强作用，且中剂量乙酸乙酯提取物的作用较强。

在测定TNF-α和IFN-γ分泌水平时发现，中剂量的月见草花乙酸乙酯提取物可显著增加环磷酰胺免疫抑制小鼠TNF-α和IFN-γ分泌水平，中剂量的月见草花水提取物可提高TNF-α的分泌水平;月见草花乙酸乙酯提取物与水提取物相比，对小鼠TNF-α分泌水平的调节作用更好一些。表明月见草花两种提取物对小鼠的TNF-α和IFN-γ分泌具有不同程度的上调作用，而TNF-α和IFN-γ分泌水平提高会对小鼠的体液免疫和细胞免疫功能产生影响。在体内，细胞因子互相影响和制约，以网络形式发挥效应，月见草花提取物能提高局部微环境中TNF-α和IFN-γ分泌水平升高，IFN-γ和IL-12能促进Th0细胞向Th1细胞分化，Th1细胞通过分泌IFN-γ、IL-2和TNF-β，增强机体T细胞免疫。提示月见草花提取物可以通过调节机体细胞因子的分泌水平发挥免疫调节作用。

从本次的研究结果看，中剂量的两种月见草花提取物均可明显增强ConA 刺激的免疫抑制小鼠T淋巴细胞增殖反应，同时，免疫抑制小鼠的TNF-α、IFN-γ等细胞因子的分泌水平也明显提高。可以认为，两种月见草花提取物对免疫抑制小鼠细胞免疫具有积极的调节作用，并且乙酸乙酯提取物的作用效果明显优于水提取物。本实验只是对月见草花不同提取物对免疫抑制小鼠细胞免疫调节的初步探讨，为全面了解月见草花对机体免疫功能的影响，尚需要采用多种动物模型来研究和证实月见草花的免疫调节作用，展开其免疫调节作用的相关研究，探究其作用机理，并进一步开展月见草花有效成分的确定及作用机制的研究，阐明其药理作用的分子机制、构效关系。

【参考文献】

[1] 于漱琦，田永清.我国月见草属植物的种类及分布[J].特产研究，1999，(4)：60-62.

[2] Dines CK，Cotter AM，Cameron NE，et al.Nerve function in galactosaemic rats：effects of evening primrose oil and doxazosin[J]. European Journal Pharm acology，1995，281(3)：303-309.

[3] Genolet PM，Delaloye JF，De Grandi P.Diagnosis and treatment of astodynia[J].Red Med Sruisse Romande，1995，115(5)：385-390.

[4] 张 兰，李占海.月见草的研究进展[J].内蒙古中医药，2005，(5)：51-53.

[5] 徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，1991：1221-1222.

[6] 钱玉昆，殷金珠.实用免疫学新技术[M]. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1994：49-50.