不同温度对小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤的影响

　　作者：张晓丽 夏世金 严震文 肖婧 张振兴 叶志斌 作者单位：复旦大学附属华东医院肾内科，上海 200040

　　【摘要】目的 探讨不同温度对小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤(IRI)的影响及其机制。方法 雄性C57BL/6N小鼠随机分为假手术组(sham组)、轻度低温IRI组(LTI)、常温IRI组(NTI)和高温IRI组(HTI)。采用夹闭双侧肾蒂35 min再灌注48 h制成IRI模型。观察IRI小鼠肾脏组织病理学改变，检测肾功能、肾组织丙二醛(MDA)含量和肾小管上皮细胞凋亡数目。结果 与Sham组相比，常温IRI组小鼠发生中等程度肾损伤，其Scr升高〔(237.0±41.2)μmol/L〕，肾组织形态学改变，肾组织中MDA含量升高〔(1.54±0.37)μmol·L-1·mg-1〕，肾小管上皮细胞凋亡数目增加。高温明显加重小鼠的IRI损伤(P<0.05)，轻度低温对小鼠IRI具有保护作用。结论 缺血阶段体温的高低明显影响小鼠肾IRI的程度，轻度低温可能通过抑制脂质过氧化反应和细胞凋亡对小鼠发挥保护作用;高温则可能通过促进脂质过氧化反应和细胞凋亡加重肾IRI。

　　【关键词】 高温;肾脏;缺血再灌注;凋亡

　　肾脏是一高灌注器官，对缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，IRI)异常敏感，故IRI成为急性肾损伤的重要损伤环节〔1〕，也是影响肾移植中移植肾早期功能恢复及长期存活的主要因素〔2〕。鉴于肾IRI病理生理学机制复杂〔3〕，涉及此方面的研究一直走在移植学研究的前沿。肾IRI动物模型为急性缺血性肾损伤的发生机制和防治策略研究奠定了基础。制作肾IRI动物模型的方法包括双侧肾蒂夹闭、双侧肾动脉夹闭、单侧肾切除+对侧肾动脉夹闭等。手术方法不同、血管夹闭的时间长短、手术操作过程中温度的控制均对实验结果有着重要影响，尤其是术中温度在此过程中起着不可忽视的作用。本文通过调控肾缺血过程中小鼠体温，观察不同温度对小鼠肾IRI的影响，以期为临床上辅助治疗IRI的新途径提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　雄性C57BL/6N小鼠24只，22～26 g(SPF级，中科院上海实验动物中心)，随机分假手术(Sham)组、轻度低温IRI组(LTI)、常温IRI组(NTI)和高温IRI组(HTI)，每组6只。

　　1.2 模型制作

　　2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，取腹正中切口，钝性分离肾蒂，无创动脉夹夹闭双侧肾蒂造成肾缺血，持续夹闭35 min后松开动脉夹，恢复血流，观察1 min，肾脏由暗紫色逐渐转为鲜红色，表明再灌注成功，缝合伤口。Sham组只分离肾蒂，关腹。再灌注48 h后，采血并处死小鼠，留取肾组织备用。LTI组在室温无热板状态下进行手术;NTI组手术在热板上进行，手术过程中每5 min测1次体温，通过开关调控热板温度，使小鼠体温始终维持在36.0℃～37.0℃之间;HTI组整个手术也在热板上进行，温度不受控制。体温采用肛温测定法。

　　1.3 指标检测

　　1.3.1 肾功能检测

　　眶下静脉丛采血，分离血清，酶法测定小鼠血清肌酐(Scr)水平(日立全自动生化分析仪)。

　　1.3.2 肾组织病理学检查

　　10%中性甲醛固定肾组织，制作石蜡切片，常规HE染色，显微镜下观察肾脏病理改变。根据肾小管细胞扁平、管腔扩张、细胞脱落坏死、肾小管管型堵塞、间质水肿，炎症细胞浸润及出血等观察肾小管间质损伤情况。

　　1.3.3 肾组织丙二醛(MDA)水平检测

　　取新鲜肾组织100 mg制成匀浆，采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书操作。

　　1.3.4 细胞凋亡的检测

　　采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)，按试剂盒(德国Roche公司)说明书进行操作。每一切片选取10个视野，在200倍光镜下，盲法观察染色阳性细胞数。

　　1.4 统计学分析

　　数据采用x±s表示。多组间的比较采用单因素方差分析(Oneway AVON)，采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。

　　2 结 果

　　2.1 各组小鼠的平均体温

　　肾脏缺血35 min后，LTI组小鼠平均体温为(32.8±0.6)℃;NTI组小鼠平均体温为(36.8±0.4)℃;HTI组小鼠平均体温为(39.0±0.8)℃。

　　2.2 各组小鼠肾功能测定和肾组织MDA表达

　　与Sham组相比，LTI组小鼠Scr升高不明显;NTI组和HTI组小鼠Scr均明显升高，且HTI组Scr升高程度较NTI组更加明显。与Sham组相比，LTI组小鼠肾组织MDA无明显升高，NTI组和HTI组肾组织MDA水平均较Sham组明显增加(P<0.05)，以HTI组增加更为显著(P<0.05)。见表1。表1 各组小鼠Scr水平和肾组织MDA水平(略)

　　2.3 各组小鼠肾脏病理学改变

　　HE染色结果显示，NTI组和HTI组小鼠肾组织病理学改变明显，受损部位集中在外髓内带的近端小管，主要表现为刷状缘脱落，肾小管细胞扁平、脱落，管腔扩张，肾小管管腔内被管型堵塞，间质水肿，炎症细胞浸润和出血;HTI组比NTI组小鼠肾损伤更为严重，甚至出现了肾小管坏死和细胞融合。LTI组小鼠肾脏无明显病理学改变。见图1。

　　2.4 各组小鼠肾组织细胞凋亡的检测

　　结合苏木素染色结果显示，Sham组和LTI组小鼠肾组织中仅见少量肾小管上皮细胞凋亡;NTI组和HTI组小鼠肾小管上皮细胞呈现出明显的凋亡迹象，凋亡细胞主要集中在皮髓交界、髓质，且HTI组细胞凋亡数目较NTI组增加明显。见图2。

　　3 讨 论

　　近年来大量研究表明，轻、中度低温(28℃～35℃，亚低温)对因创伤、缺血等多种原因导致的颅脑损害具有显著的保护作用，并已逐渐在临床上推广应用〔4〕，低温治疗在心脏停搏复苏患者中也获得了显著疗效〔5，6〕。目前普遍认为亚低温减轻脏器缺血损伤的机制可能在于改变机体正常代谢环境，降低组织细胞的代谢需求。

　　然而迄今有关温度对急性缺血性肾损伤的研究报道相对较少，尤其是涉及高温对肾IRI影响的研究更为少见。90年代初，Zager等〔7〕曾提出温度对缺血缺氧肾小管上皮细胞中ATP的丧失及细胞代谢率有显著影响，且他们认为高温仅对IRI的缺血阶段产生影响，而对再灌注阶段影响不大〔8〕。

　　本研究发现，再灌注48 h后高温IRI组小鼠的肾损伤程度最重，表现在Scr水平明显升高;肾组织结构严重破坏，大量小管坏死、管型形成;同时肾脂质过氧化产物(MDA)含量明显上调;细胞凋亡数目明显增加。常温IRI组小鼠肾脏呈现中等程度的损伤，而轻度低温IRI组小鼠肾脏则未见明显损伤。因此，缺血阶段体温高低明显影响肾脏缺血再灌注后期损伤的程度，轻度低温对肾脏IRI具有保护作用，而高温则加重肾损伤。

　　目前有许多理论来诠释温度改变对脏器IRI的影响。有观点认为，亚低温对心、脑血管缺血损伤的保护作用不能仅用代谢率变化来解释，还存在其他重要的机制，主要包括抗自由基损伤、抑制免疫和炎症反应、抗凋亡以及抑制离子泵的活性等〔9〕。相反，高温则增加了细胞做功和能量需求。之前有学者提出，体温每增加1℉，细胞氧耗将增加6%。由此，温度升高或降低将直接影响细胞的能量供需平衡。随温度增加，高能量磷酸盐复合物ATP、ADP、AMP、GTP和GDP浓度降低〔8〕。值得指出的是，高温加重动物IRI是由于高温影响了缺血阶段的代谢进程，而非热损伤的直接作用，假如单将动物暴露于高温环境下，并不发生缺血损伤，那么这些动物的能量需求将不发生改变〔10〕。

　　综上，温度极大影响着缺血性肾损伤的严重程度。研究者从事相关基础或临床研究时，只有严格把握受试对象的温度，其研究结果及干预措施才具有可靠性和可比性。

　　【参考文献】

　　1 Thadhani R，Pascual M，Bonventre JV.Acute renal failure〔J〕.N Engl J Med,1996;334(22):144860.

　　2 Moreso F，Gallen M，GarciaOsuna R,et al.Multivariate analysis of prognostic factors in renal transplantation〔J〕.Transplant Proc,1995;27(4):22268.

　　3 Carden DL，Granger DN.Pathophysiology of ischemia reperfusion injury〔J〕.J Pathol,2000;190(3):25566.

　　4 Tisherman SA.Hypothermia and injury〔J〕.Curr Opin Crit Care,2004;10(1):5129.

　　5 Bernard SA，Gray TW，BuistMD,et al.Treatment of comatose survivors of outofhospital cardiac arrest with induced hypothermia〔J〕.N Engl J Med,2002;346(8):55763.

　　6 Hypothermia after Cardiac Arrest Study Group.Mild therapeutic hypothermia to improve the neurologic outcome after cardiac arrest〔J〕.N Engl J Med,2002;346(8):54956.

　　7 Zager RA，Gmur DJ，Bredl CR,et al.Temperature effects on ischemic and hypoxic renal proximal tubular injury〔J〕.Lab Invest,1991;64(6):76676.

　　8 Zager RA.Hyperthermia：effects on renal ischemic/reperfusion injury in the rat〔J〕.Lab Invest，1990;63(3):3609.

　　9 Smith WS.Pathophysiology of focal cerebral ischemia：a therapeutic perspective〔J〕.J Vasc Interv Radiol,2004;15(1Pt2):S312.

　　10 Delbridge MS，Shrestha BM，Raftery AT,et al.The effect of body temperature in a rat model of renal ischemiareperfusion injury〔J〕.Transplant Proc,2007;39(10):29835.