NS-398通过转化生长因子-β/Smad信号通路对肾小球系膜细胞环氧化酶-2表达的影响

　　作者：陈玉莲， 陈晓岚 李辉， 丁斐 作者单位：1南通大学附属医院肾内科， 南通 226001;2江苏省神经再生重点实验室

　　【摘要】 目的：探讨COX-2抑制剂NS-398对转化生长因子-β(TGF-β)影响肾小球系膜细胞表达环氧化酶-2(COX-2)及Smad2 mRNA表达的作用。方法：传代培养系膜细胞后取第4代系膜细胞进行分组实验，用RT-PCR方法测定各组COX-2 mRNA及Smad2 mRNA的表达，观察不同浓度TGF-β在4、12、24 h对COX-2 mRNA及Smad2 mRNA表达的影响，及NS-398对其的抑制作用。结果：不同浓度TGF-β作用不同时间后，系膜细胞COX-2 mRNA和Smad2 mRNA表达均增加，呈浓度和时间依赖性。与TGF-β组相比，加入COX-2抑制剂NS-398后，COX-2 mRNA和Smad2 mRNA表达均减少。结论：TGF-β刺激肾小球系膜细胞COX-2表达的信号通路之一是Smad信号通路。而COX-2抑制剂NS-398对COX-2表达的抑制机制之一是通过此信号通路。

　　【关键词】 肾小球系膜细胞;环氧化酶-2抑制剂;转化生长因子-β;Smad2 ;环氧化酶-2;大鼠

　　Effects of inhibitor of COX-2 on the expression of cyclooxygenase-2 by transforming growth

　　factor β and Smad signaling pathway in cultured rat mesangial cells

　　CHEN Yulian , CHEN Xiaolan, LI Hui, et al (1Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001， 2The Jiangsu Key Laboratory of Neuroregeneration)

　　[Abstract] Objective: To investigate the effects of inhibitor of COX-2 on the expression of cyclooxygenase-2 by transforming growth factor β and Smad signaling pathway in cultured rat mesangial cells. Methods: Using the quart glomerular mesangial cell for experimentation, to observe the effect of different concentrations of TGF-β on the expression of COX-2 and Smad2 mRNA at 4, 12 and 24 hours, and the effect of the inhibitor of COX-2 NS-398 on the expression of COX-2 and Smad2 mRNA. The expression of COX-2 mRNA and Smad2 mRNA was determined by RT-PCR. Results: After the glomerular mesangial cell was irritated by TGF-β, the expression of COX-2 mRNA and Smad2 mRNA increased. This depended on the density of TGF-β and the length of TGF-β acting time. After NS-398(inhibitor of COX-2) was added, the expression of COX-2 mRNA and Smad2 mRNA reduced, which depended on the length of NS-398 acting time. Conclusion: One of the signaling pathways through which TGF-β increases the expression of COX-2 is the Smad signaling pathway. NS-398 restraining the expression of cyclooxygenase-2 may be related with TGF-β/ Smad signaling pathway.

　　[Key words] Glomerular mesangial cell; Inhibitor of cyclooxygenase 2; Transforming growth factor β; Smad2; Cyclooxyge nase 2; Rat

　　转化生长因子β(TGF-β)是一种多功能的细胞因子，有3种受体，只有Ⅰ、Ⅱ型是Smad信号通路必须的，具有膜结合丝氨酸/苏氨酸活性[1]。Smad蛋白是目前所知的唯一TGF-β受体的胞内激酶底物，为TGF-β受体后下游的信号转导因子，介导了TGF-β的胞内信号转导[2-3]。TGF-β可促使肾脏ECM沉积，因此它在肾小球疾病进展中的作用得到了许多关注[4]。环氧化酶(COX)是前列腺素合成的重要限速酶，是花生四烯酸转化为前列腺素(PG)的催化酶，在炎症反应中起重要作用。COX-2源性的前列腺素类化合物在肾脏病的发病中有重要作用[3]。研究表明给予选择性COX-2抑制剂—氮-2，环己氧，4，硝基苯-甲基磺胺(NS398)可减少蛋白尿和抑制肾小球纤维化的进展[4]，还可减少残余肾TGF-βm RNA的表达和Ⅲ、Ⅳ型胶原的表达。本文通过研究NS398对肾小球系膜细胞中COX-2表达的抑制作用是否通过TGF-β/Smad信号通路而实现，以探讨COX-2抑制剂的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂配置 按照说明书将TGF-β1粉剂用含1%牛血清白蛋白的4 mmol/L HCl配置成1000 ng/ml的贮存液(pH7.2~7.4)，用消毒好的滤器过滤后，分装于1.5 ml的EP管中，-20 ℃保存备用。将NS-398用DMSO配制成1 000 μmol/L，过滤除菌后分装于1.5 ml的EP管中，避光，4 ℃保存备用。用PBS将Staurosporine(Smad2抑制剂)配制成250 nmol/ml，过滤除菌后分装于1.5 ml的EP管中，避光，4 ℃保存备用。使用前以RPMI-1640细胞培养液或PBS稀释成所需浓度， 在临用前新鲜配制。

　　1.2 系膜细胞培养和实验分组 系膜细胞的来源：购自上海第二军医大学附属长征医院肾脏病实验室，为大鼠肾小球系膜细胞系。对数生长期的系膜细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液的60 MM培养皿中，置37 ℃、5 %CO2培养箱中培养，待细胞80%~90% 融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后传代培养， 取第4代融合状态系膜细胞调至1×107分别加入50 ml塑料培养瓶和24孔培养板中，待成融合状态时加入无血清RPMI1640培养液同步培养24 h使其进入静止期。分别设(1)对照组;(2)TGF-β(5 ng/ml)组(A组);(3)TGF-β(10 ng/ml)组(B组);(4)TGF-β+NS-398 (10 μmol/L NS-398 +10 ng/ml TGF-β) 组(C组);(5)TGF-β+Staurosporine(5 nmol/ml Staurosporine+10 ng/ml TGF-β)组(D组);以Staurosporine干预30 min后加TGF-β刺激，加入相应的培养液，每组复设3孔。

　　1.3 RT-PCR法检测各组系膜细胞内Smad2、COX-2 mRNA的表达

　　1.3.1 细胞总的RNA的提取 在加入不同物质作用后4、12、24 h收集细胞，采用Trizol抽提试剂盒提取总RNA，且用紫外分光光度计测RNA在260和280 nm的吸收度 (OD值)，计算RNA的含量和纯度。大鼠肾小球系膜细胞的GAPDH，Smad2，COX-2的基因序列通过基因库获得，根据Primer 3软件设计引物，再经GenBank BLAST进行同源性检测，引物设计通过Primer5.0软件完成，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物的序列及扩增片段长度见表1。

　　1.3.2 RT-PCR 参照逆转录试剂盒(Promega公司)说明书方法先逆转录合成第1条cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应，按不同PCR反应条件在PCR扩增仪上进行实验扩增。GAPDH：94 ℃预变性5 min，92 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环30次，72℃延伸3 min;Smad2：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循环30次，72℃延伸7 min;COX-2：94 ℃预变性5 min，92 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，72 ℃延伸5 min。4 ℃终止，产物储存于-20 ℃。

　　取10 μl PCR产物以1.2 %琼脂糖凝胶电泳(含终浓度为5 μg/ml的溴化乙锭)后紫外检测仪观察，用凝胶图像成像系统成像及进行扫描定量分析DNA，以目的片段/内参照GAPDH片段的条带光密度(OD)作半定量值比较。至少重复3次独立的RT-PCR全过程。

　　1.4 统计学方法 采用Stata 7.0软件，计量数据以■±s表示;各处理组与空白对照组之间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 NS-398抑制 TGF-β对COX-2 mRNA表达的影响 对照组有微弱的COX-2 mRNA表达，用不同浓度的TGF-β作用不同时间后COX-2 mRNA表达量明显增加，呈浓度和时间依赖性，TGF-β的此种作用能被NS-398和Staurosporine所抑制，且呈时间依赖性，见表1、图1~3。

　　2.2 NS-398抑制 TGF-β 对细胞内Smad2 mRNA表达的影响 对照组有微弱的Smad2 mRNA表达，用不同浓度TGF-β刺激后Smad2mRNA表达量在4 h后开始升高，呈时间依赖性和浓度依赖性。TGF-β的此种作用能被NS-398和Staurosporine所抑制，且呈时间依赖性，见表2、图4~6。

　　3 讨论

　　TGF-β是各种肾脏病如肾小球硬化和肾间质纤维化发生、发展的必需因子， 其过度产生在许多肾脏病中引起了不可逆的间质纤维化[3]，有研究表明TGF-β可诱导多种细胞分泌合成COX-2，如成纤维细胞和平滑肌细胞等，且能活化调节COX-2启动基因的因子如AP-1和NF-KB。动物(狗和鼠)和灵长类(猕猴和人)的肾脏都有COX-2和COX-1的表达， COX 产物的多样性与其受体的多样性决定了COX产物在肾脏中表现出复杂的生物学作用，COX-2 是与炎症相关的酶，其可被内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞所分泌的炎症介质所诱导产生，动物实验证实[5]，使用特异性COX-2 抑制剂可明显减少蛋白尿，作为COX-2 的代谢产物尿TXB2 也明显减少，病理检查示大鼠肾小球硬化程度也明显减轻。

　　我们分别用5、10 ng/ml TGF-β刺激系膜细胞4、12、24 h，发现肾小球系膜细胞中COX-2 mRNA的表达随时间的增加而表达增加，且在相同时间段不同浓度的TGF–β刺激系膜细胞后COX-2 mRNA的表达随TGF-β浓度的增加而增加，说明TGF-β与COX-2 mRNA表达之间存在量效和时效关系，其机制可能为TGF-β活化了COX-2的启动因子等，使COX-2表达增加。 同时发现用不同浓度TGF-β刺激4、12、24 h后Smad2 mRNA 的表达在4 h开始增加，呈时间和浓度依赖性，其可能机制为肾小球系膜细胞内Smads通路在正常状态下处于非激活状态，TGF-β刺激能特异性激活该通路，使Smad2磷酸化而与同类Smad 形成复合体，介导信号转导[6-7]。加入COX-2抑制剂NS-398后，COX-2的表达明显减少，呈时间依赖性，提示 NS-398抑制了TGF-β的作用。有研究发现在相同条件下，TGF-β会增加角质化细胞中COX-2 mRNA的表达，加入NS-398会减少TGF-β引起COX-2 mRNA的表达，可能与NS-398降低COX-2启动因子的活性有关[8]，我们的实验结果也可能与此机制有关。此外，加入NS-398后，Smad2的表达明显减少，提示NS-398能同时抑制COX-2和Smad2的表达，其可能机制为NS-398抑制了由TGF-β诱导的Smad2的磷酸化和它的重要功能，即抑制Smad2和Smad4的结合，阻碍Smad2在细胞内的蓄积，进而阻碍TGF-β应答基因的活化，从而减少COX-2的表达，起到肾保护作用。在本试验中，我们同时加入Smad2的抑制剂Staurosporine后，COX-2和Smad2mRNA的表达明显减少，提示Staurosporine能抑制TGF-β的信号通路。同时由于TGF-β与Smad2的结合使其信号通路中起激活作用的物质减少，对COX-2启动因子的激活减少，而使COX-2的表达减少。说明TGF-β/Smad2信号通路与COX-2的表达有明显关系。

　　【参考文献】

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