孕激素受体与TNF-α、IL-1β、NF-κB在自然流产蜕膜组织中的表达及临床意义

　　自然流产(SpOntaneous abortion)是指妊娠28周以前、胎儿体重<1 000 g的自然丢失，是妊娠最常见的并发症之一，对人类的生殖有着重大的威胁。而至今约有50%左右的自然流产病因未明，称之为不明原因性复发性流产(Unexplained recurrent SpOntaneous abortion，URSA)，常表现为无任何症状出现时胚胎已停止发育[1]。目前，甾体类激素受体与炎性细胞因子在不明原因自然流产的发生中充当何种角色越来越受到研究者的关注。孕激素对于排卵、受精乃至整个妊娠的维持均起着非常重要的作用，然而，其功能的形使主要是靠孕激素受体(Progesterone receptor，PR)来实现的[2]。研究发现，反复自然流产患者的雌二醇和孕酮水平以及两者间的比率、雌激素受体(ER)水平与无自然流产史人群无明显差别，但其孕激素受体(PR)水平较无自然流产史人群明显减低[3];又有研究显示，炎性反应细胞因子(如IL-1β)增强NF-κB转录活性时可明显抑制羊膜上皮细胞中 PR的转录活性[4]。由此提示PR的减少可能是导致不明原因自然流产的原因，可能与炎性细胞因子的参与有关。因此，本研究检测了自然流产蜕膜组织中PR与TNF-α、IL-1β、NF-κB的表达并分析其临床意义。

　　1 资料与方法 1.1 一般资料：本研究经广东省佛山市禅城区澜石医院伦理委员会批准后开展实施。收集2011年4月～2012年10月就诊于我院妇产科门诊及住院部的不明原因自然流产患者33例(研究组)，年龄18～37岁，平均(26.7±7.3)岁，停经时间44～79 d，平均(57.2±8.5)d。所有患者均符合以下条件：①妊娠12周以内，有下腹痛伴阴道流血，B超显示胚胎停止发育;②患者无保胎药物治疗和其他服药史(如黄体酮保胎治疗)，无感染史及其他内科疾病，排除抗磷脂抗体阳性和染色体异常。选择同期就诊我院门诊自愿要求人工流产的妇女33例设为对照组，年龄20～42岁，平均(28.6±6.5)岁，停经时间45～66 d，平均(54.9±5.2) d。且所有妇女均符合以下条件：①妊娠期无先兆流产症状和体征。②B超显示胚胎发育正常。③无自然流产和死胎史，无其他内科疾病，无感染史及其他服药史。

　　1.2 主要试剂盒：Total RNA Kit(Omega公司);逆转录试剂盒(Reverse transcription system)(Promega公司);RT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqTM反应体系(TaKaRa公司)。

　　1.3 标本采集：在获取入选对象知情同意并详细记录其人口统计学特征及相关临床资料。采用吸刮的方式获取蜕膜组织，用无菌生理盐水冲洗后以无酶管分装，保存于-80℃冰箱或液氮中备用。

　　1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测蜕膜组织PR、NF-κB、TNF-α和IL-1βmRNA的表达：取50～100 mg冻存组织放入碾钵碾碎，加入适量Trizol(1 ml/100 mg)并不断研磨，在此过程中可不断补充液氮。严格按照试剂盒操作步骤提取总RNA，并反转录成cDNA，再进行qRT-PCR扩增。各扩增基因引物如下：

　　PR：L-5'-AAATC ATTGCCAGGTTTTCG-3'，R-5'-TGCCACATGGTAAGGCATAA-3'; NF-κB：L-5'-CCTGGATGACTCTTGGGAAA-3'，R-5'-TCAGCCAGCTGTTTCATGTC-3'; TNF-α：L-5'-TCAGAGGGCCTGTACCTCAT-3'，R-5'-GGAAGACCCCTCCCA GATAG-3'; IL-1β：L-5'-GGACAAGCTGAGGAAGATGC-3'，R-5'-TCCATATC CTGTCCCTGGAG-3'; β-actin：L-5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，R-5'-GG GCACGAAGGCTCATCATT-3'。与内参基因β-actin标化，以2-ΔΔCT值表示目的基因相对表达量。

　　1.5 统计学方法：使用SPSS 13.0对各项资料进行统计、分析，各项参数以均数±标准差( s x± )表示，采用t和χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果 2.1 蜕膜组织PR mRNA表达：采用qRT-PCR我们检测了蜕膜组织PR的表达情况。与正常人工流产蜕膜组织比较，不明原因自然流产蜕膜组织PR mRNA表达明显降低(P=0.011)。详见图 1。

　　2.2 蜕膜组织NF-κB、TNF-α和IL-1β mRNA表达：检测蜕膜组织中部分炎性反应因子的表达情况。详见图2。与正常人工流产蜕膜组织比较，不明原因自然流产蜕膜组织NF-κB、 TNF-α和IL-1β mRNA表达明显增强(P<0.001，P=0.008， P=0.009)。 2.3 蜕膜组织PR表达与NF-κB表达的相关性分析：相关性分析显示，不明原因自然流产蜕膜组织中PR表达与NF-κB表达明显负相关(r=-0.508，P<0.013)，详见图3。 2.4 蜕膜组织TNF-α、IL-1β表达与NF-κB表达间的关性分析：详见图4。不明原因自然流产蜕膜组织中TNF-α、IL-1β 的表达均与NF-κB的表达显著呈正相关，相关系数分别为 r=0.680，P<0.001，r=0.670，P<0.001。

　　3 讨论孕激素在孕卵着床过程中必不可少，其生物作用的发挥也必需依赖于受体，即孕激素受体(Progesterone receptor，PR)。 PR具有专一性，缺少PR的组织，不能对孕激素产生任何生物效应，并且孕激素对组织产生作用的强度，与组织中PR的量以及 PR被消耗后细胞对其再生的能力有关。当组织细胞中PR浓度升高时，细胞对孕酮的生理反应也随之递增，并为孕卵的着床奠定良好的基础[5]。阻断孕激素与其受体的结合可以终止妊娠反应，如目前较常用的米非司酮药物流产就是利用米非司酮结合蜕膜组织中的孕酮受体，阻断孕激素的作用，使蜕膜组织变性坏死从而终止早孕。大量研究显示，PR在正常早孕组蜕膜中有较高水平的表达，而在自然流产蜕膜组织中表达明显减少[6-7]。由此说明适量的PR水平对维持正常妊娠有着重要的作用，PR的减少可能是导致不明原因自然流产的主要原因之一。在本研究中，发现不明原因自然流产蜕膜组织PR mRNA表达明显低于正常人工流产组蜕膜组织中的表达(P<0.05)，结果提示PR数量减少是引起不明原因自然流产的重要因素，值得深入研究。

　　NF-κB是一种重要的核转录因子，广泛参与启动与细胞增殖、分化及凋亡等相关基因的转录，调节机体炎性反应和免疫反应。近来研究显示NF-κB与生殖活动密切相关，参与调节胚胎的着床和发育等生理和病理过程，其活性的降低对妊娠的成功维持极为重要。正常妊娠早期子的宫内膜和蜕膜组织中NF-κB的表达呈下调趋势，减少免疫抑制，以便妊娠的维持;同时，末梢循环 T淋巴细胞中的NF-κB在妊娠妇女的表达明显低于非孕妇女[8]。吕丽贤等发现，早期妊娠流产患者滋养细胞中NF-κB的表达明显高于正常妊娠行人工流产患者，这也提示NF-κB的表达增强和活化可能参与了早期流产发病的机制之一[9]。研究表明TNF-α和IL-1β 与胚胎的发育也密切相关[10]。女性生殖道、胎盘组织、胚胎以及黄体细胞、闭锁卵泡等内广泛存在TNF-α基因的表达[11]。妊娠时适量的TNF-α有利于细胞代谢及胚胎的发育，促进绒毛膜促性腺激素和孕激素的合成，从而有助于降解蜕膜细胞外的基质和胎盘植入[12]。而当母体免疫功能异常或某些因素激活巨噬细胞、中心粒细胞等白细胞时，导致TNF-α水平异常升高，可影响胚胎的发育。有反复自然流产史的早期妊娠妇女血清TNF-α水平显著高于正常早孕妇女，在母胎界面组织中存在某些因素促进TNF-α分泌增多，促进滋养细胞发生凋亡，导致绒毛生长抑制，蜕膜坏死，进而阻碍孕卵的发育[13-14]。同样，IL-1β可能参与了胚胎的发育与着床、蜕膜化、分娩等多个生殖环节[15]。如IL-1β可通过调节孕妇组织中绒毛膜促性腺激素、前列腺素E2、胎盘催乳素等物质的活性，阻止宫内膜基质细胞蜕膜化过度，促进胚胎植入及生长发育[16]。排除外来炎性反应干扰时，异常增多的IL-1β可与其他细胞因子协同促进孕妇前列腺素E2的产生，增强细胞毒性和炎性反应，影响胚胎发育[17]。在本研究中，NF-κB、TNF-α和IL-1β 在不明原因自然流产蜕膜组织中的表达较正常人工流产组显著增强(P<0.05)，提示NF-κB、TNF-α和IL-1β的异常表达参与了自然流产。

　　研究显示TNF-α和IL-1β可明显增强NF-κB的转录活性，而NF-κB的活化又可增强TNF-α和IL-1β的转录水平，使 TNF-α和IL-1β产生增加，进一步活化NF-κB，产生级联放大效应[18]。又有研究显示，过表达PR可以显著抑制NF-κB的转录活性，而IL-1β在增强NF-κB转录活性的同时却可抑制PR的转录活性[19]，抑制局部炎性反应[20];PR-A和PR-B完全敲除的乳腺癌T47D细胞NF-κB p65如核显著增多[21];采用IL-1β缺陷妊娠小鼠研究发现，IL-1β对NF-κB的调节在胚胎植入和发育过程中起了重要作用[22]。本研究发现，不明原因自然流产蜕膜细胞中 TNF-α和IL-1β的表达均与NF-κB的表达呈正相关，而NF-κB 的表达与PR的表达呈负相关。这提示NF-κB与TNF-α、IL-1β 相互作用，使炎性反应级联放大，不利于胚胎的发育;与此同时，表达增强和活化的NF-κB可能通过某种机制使PR生成减少，消弱孕激素的作用，引起子宫蜕膜发育不良，最终导致流产的发生。

　　综上所述，本研究发现，不明原因自然流产蜕膜组织中NF-κB、TNF-α和IL-1β大量表达，NF-κB的活性增强，但PR表达明显减少，TNF-α、IL-1β的表达均与NF-κB的表达呈正相关，而NF-κB的表达与PR的表达呈负相关。其结果提示，PR的减少可能是导致不明原因自然流产的原因，可能与NF-κB的激活启动炎性反应有关，其机制有待进一步深入研究，可为不明原因自然流产的治疗开辟新途径。

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