纤溶酶原激活物抑制物-1基因4G/5G多态性与内蒙古汉族人群IgA肾病患者病理特点的相关性研究

　　作者：张艳辉1 王 慧1 杜 宇1 韩丽红2 王彩丽1 作者单位：(1.包头医学院第一附属医院肾内科， 2.包头医学院生化教研室, 内蒙古包头 014010)

　　【摘要】 目的：研究内蒙古汉族人群IgA肾病(IgAN)患者纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)基因4G/5G多态性与肾脏病理特点的关系。方法：采集100例肾活检证实的IgAN患者血样,提取基因组DNA，采用等位基因特异聚合酶链反应(ASPCR)法进行PAI-1的4G/5G基因型分析，探讨PAI-1基因型及等位基因频率与IgAN各种病理类型的关系、PAI-1基因型及等位基因频率与IgAN肾小球硬化的关系。结果：肾脏病理表现为HassⅠ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ级的IgAN患者之间，PAI-1基因型及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05);硬化组4G/4G基因型的频率显著高于非硬化组(P<0.05),但硬化组4G等位基因频率(67%)与非硬化组4G等位基因频率(57%)相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论：PAI-1基因型频率和等位基因频率与IgAN的病理损害程度无关，PAI-1基因4G/5G多态性与IgAN肾小球硬化显著相关，4G/4G纯合子易发生肾小球硬化。

　　【关键词】 IgA肾病;纤溶酶原激活物抑制物-1;基因;多态性;病理特点;相关性

　　IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是常见的自身免疫性疾病，其最主要的特征是免疫荧光下可见IgA为主的免疫球蛋白弥漫沉积于系膜区，临床及病理表现多样化，预后相差悬殊。IgAN发病机制尚不清楚，越来越多的证据表明遗传因素决定该病的易感性，高的病理损伤积分或病理分级也提示预后不佳，影响着疾病的进程。因此有必要对有关IgAN遗传背景及与临床病理之间的关系进行研究。IgAN进展过程中,细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)增多是引起肾脏ECM积聚并导致肾纤维化的重要机制。纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是一种丝氨酸蛋白水解酶抑制剂,除具有纤维蛋白溶解作用外,还具有ECM的降解、激活酶原和潜在的生长因子作用。有研究表明,PAI-1在进展性肾脏疾病(包括肾小球硬化和小管间质纤维化)中起重要作用。本研究旨在基因水平上探讨内蒙古地区汉族人群PAI-1基因与IgAN病理损害的相关性。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 IgAN组:1997-2007年在包头医学院第一附属医院就诊的IgAN患者100例，男性53例,女性47例，年龄18～45岁，平均年龄31.4岁;均经肾穿刺免疫荧光证实为IgAN，病理诊断符合肾活检病理诊断标准指导意见[1]，临床排除系统性红斑狼疮(SLE)、过敏性紫癜、慢性肝脏疾病等继发性IgAN,病理分级符合Haas分级标准[2]。对照组：100例年龄、性别与IgAN患者组匹配的健康体检者及献血员，尿检均无异常，其中男性51例，女性49例，年龄22～32岁，平均年龄27.0岁。两组人群系内蒙古地区无血缘关系的汉族人群。

　　1.2 标本收集及临床指标检测 DNA血样的收集：对照组及IgAN组(肾穿当日)均晨起空腹，每人静脉取外周血2 mL，枸橼酸钠抗凝，置于EDTA管内，-40 ℃冰箱保存。抽血前均未用过影响血液流变学的药物，如抗凝剂及其他降脂药和皮质醇类药物。IgAN的Haas分级标准：Ⅰ级为轻微性肾小球病变或轻度系膜增生性肾小球肾炎不伴有肾小球坏死;Ⅱ级为局灶节段性肾小球坏死无活动性细胞增生;Ⅲ级为局灶增生性肾小球坏死;Ⅳ级为弥漫增生性肾小球肾炎;Ⅴ级为肾穿刺活检显示有≥40 %肾小球坏死，或有≥40 %肾小管萎缩。根据IgA肾病患者的病理检查是否伴有硬化分为两组(硬化组和非硬化组)，其中硬化组61例，男34例，女27例，年龄21～48岁，平均年龄34.8岁，非硬化组39例，男19例，女20例，年龄18～42岁，平均年龄29.1岁。

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 基因组DNA的抽提 冻存血室温融化，取50 μL加入1 mL EP管中，加双蒸水至1 mL,混匀，室温静置15 min。3 000 rpm离心1 min，弃上清液。加裂解液60 μL，振荡器上剧烈震荡，沸水煮10 min，冷却，再剧烈振荡， 11 500 rpm高速离心4 min。上清液中含有模板DNA。

　　1.3.2 PAI-1基因多态性检测 采用等位基因特异聚合酶链反应(allele specific polymerase chain reaction,ASPCR)扩增目的基因片段。特异性引物按Teresa[3]的报道设计:共同下游反向引物P1:5′-TGC AGC CAG CCA CGT GAT TGT CTA G-3′,上游正向4G引物P2:5′-GTC TGG ACA CGT GGG GA-3′、5G引物P3:5′-GTC TGG ACA CGT GGG GG-3′,同时在4G、5G上游引物更远端设立对照正向引物作为内对照,以证实4G、5G扩增的特异PCR片段非条件不适造成的非特异片段,P4:5′-AAG CTT TTA CCA TGG TAA CCC CTG GT-3′。

　　反应体系：每个样本DNA均同时进行3个体系PCR反应,即P2P1、P3P1、P4P1,PCR扩增总体系为12.5 μL,10×PCR buffer(含Mg2+)1.25 μL,dNTP 2 μL(1.25 mmol/L),上、下游引物各0.5 μL(33 μg/mL),无菌水5.75 μL,Tag酶0.5 μL，模板DNA 2 μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,61 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共35循环。最后72 ℃终末延伸10 min。

　　1.3.3 产物鉴定及分析 酶切：每个酶切体系为25 μL,其中包括：PCR扩增反应产物12.5 μL，10×Buffer 1.25 μL，dNTP 2 μL(1.25 mmol/L),上、下游引物各0.5 μL(33 μg/mL),无菌水5.75 μL,Tag酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，混匀，37 ℃水浴 5 h。电泳：应用2 %琼脂糖凝胶电泳，电压100 V,时间30 min,在紫外透射自动成像分析仪上进行成像,记录结果。

　　1.4 统计学分析 经遗传平衡检测证明,IgAN患者与对照组均符合Hardy-Weinberg平衡,具有群体代表性。应用SPSS13.0统计软件进行分析。所有统计分析中，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 PAI-1基因型及等位基因频率与IgAN各种病理类型的关系 经χ2检验，在肾脏病理分别表现为HassⅠ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ级的IgAN患者之间，PAI-1基因型及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05),即PAI-1基因型频率和等位基因频率与IgAN的病理损害程度无关。见表1。

　　2.2 PAI-1基因型及等位基因频率与IgAN肾小球硬化的关系

　　2.2.1 IgAN肾小球硬化与病情的联系 硬化组与非硬化组的性别、血压、尿蛋白定量、肾功能的差异均无统计学意义，但硬化组的平均年龄及病理分级显著高于非硬化组，镜下血尿的比例也明显较非硬化组严重，两组比较差异有统计学意义，但是两组血尿的分级水平间差异无统计学意义。虽然进入终点事件的比例是相同的，但两组相比差异还是具有统计学意义。见表2。表1 PAI-1基因型及等位基因频率与IgAN各种病理类型的关系表2 IgAN伴或不伴肾小球硬化患者临床特征比较

　　2.2.2 PAI-1基因型及等位基因频率与IgAN肾小球硬化的关系 PAI-1基因多态性在IgAN患者中的分布：非硬化组的4G/4G型、4G/5G型、5G/5G型基因频率分别为33.3 %、48.7 %和17.9 %,硬化组分别为45.9 %、42.6 %和11.5 %。硬化组4G/4G基因型的频率显著高于非硬化组(P<0.05),但硬化组4G等位基因频率(67 %)与非硬化组4G等位基因频率(57 %)相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。表3 基因多态性在伴或不伴肾小球硬化的IgAN患者中的分布

　　3 讨论

　　IgAN或Berger病最早于1968年由Berger和Hinglais提出[4]，在我国肾活检资料中约占原发性肾小球疾病的20 %～47 %[5-6]，历经30多年的研究，目前认为该病是我国最常见的原发性肾小球疾病，尤其在亚洲该病占原发肾小球疾病的近50 %[7]，以内蒙包头地区我科观察的情况为例，大概占原发性肾小球疾病的30 %左右，而且资料显示近10年有明显的上升趋势。其中约20 %～30 %的患者在起病后10～20年进展到终末期肾衰竭(ESRD)，在我国是引起终未期肾功能衰竭的重要原因之一。

　　目前的观点倾向于将IgAN视为一种具有同一免疫病理特征的、由一组疾病构成的症候群，光镜下可见本病主要累及肾小球，病理类型呈多样性，可见轻微病变、局灶节段性病变、系膜毛细血管性病变、新月体性病变、硬化性病变甚至膜性病变，但以系膜增生性病变为最常见。丁瑞等[8]报道，在按病理Lee氏分级的两组患者中,病理改变重的患者中4G/4G基因型频率显著高于病理改变轻的患者,提示4G/4G基因型患者可能具有较高的PAI-1水平和活性,从而加重4G/4G基因型患者肾脏纤维化。Suzuki等[9]研究结果显示，IgAN患者PAI-1基因4G/4G基因型在肾小球和肾小管间质的病理组织学进展方面比表现为4G/5G或5G/5G基因型的病理损伤更明显。我们的结果是在按肾脏病理Hass分级的IgAN患者之间PAI-1基因型及等位基因频率差异无统计学意义，即PAI-1基因型频率和等位基因频率与IgAN的病理损害程度无关，这可能与我们的病例选择角度及病理分级标准有关。

　　在IgAN进展过程中, ECM增多是引起肾脏ECM积聚并导致肾纤维化的重要机制。大量的ECM沉积可促进肾小球硬化的发生与发展。组织局部纤溶酶原激活物(plasminogen activator,PA)/PAI-1活性的改变能够调节ECM的积聚与降解[10]。纤溶酶原/纤溶酶系统是肾小球ECM降解的主要蛋白酶系统，纤溶酶原可被组织型和尿激酶型纤溶酶原激活物(t-PA和u-PA)激活为纤溶酶,纤溶酶不仅本身可降解ECM,而且可激活降解ECM的另一类蛋白酶系统-基质金属蛋白酶(MMPs)。PAI-1是t-PA和u-PA的特异性抑制剂,其活性增加可抑制纤溶,导致肾小球ECM降解障碍,促进ECM积聚和肾小球硬化的发生、发展[11]。因此认为PAI-1在ECM积聚过程中具有重要作用。Grandaliano等[12]证实在IgAN患者中PAI-1表达增高。在局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病中,肾小球局部PAI-1表达上调,纤溶、蛋白溶解活性的抑制与肾小球病理改变相关联[13]，说明血中或局部PAI-1表达增加参与了肾脏硬化过程。PAI-1还与血栓性微血管病和增生性或新月体性肾小球肾炎的病理遗传学进程有关。有研究表明,PAI-1在进展性肾脏疾病包括肾小球硬化和小管间质纤维化中起重要作用[14]。PAI-1在正常人肾脏不表达,但强烈影响肾脏疾病的各种进程,导致肾纤维化和终末期肾病。Hamano等[13]检测80例慢性肾小球肾炎患者肾组织PAI-1 mRNA的表达,结果显示，局灶节段硬化性肾炎患者肾小球PAI-1 mRNA水平较微小病变患者明显升高。这些研究均证实PAI-1在肾小球硬化过程中起重要作用。何立群等[15]对98名患者和95名健康体检者进行研究,探讨原发性肾小球疾病患者中PAI-1基因多态性及其产物与IgAN肾小球硬化的关系,结果表明，PAI-1 4G/4G基因型和4G等位基因与肾小球硬化显著相关,PAI-1 4G/4G基因型携带者的血浆PAI-1水平升高。而我们的结果是：硬化组4G/4G基因型的频率显著高于非硬化组,但硬化组4G等位基因频率与非硬化组4G等位基因频率相比差异无统计学意义，提示PAI-1基因4G/5G多态性与IgAN肾小球硬化显著相关，4G/4G纯合子易发生肾小球硬化，与何立群[15]的研究结果大致相似。

　　【参考文献】

　　[1] 全国肾活检病理诊断研讨会.肾活检病理诊断标准指导意见[J].中华肾脏病杂志，2001，17(4)：270-275.

　　[2] Haas M.Histologic subclassification of IgA nephropathy:a clinicopathologic study of 224 cases[J].Am Kidney Dis,1997,29:829-842.

　　[3] Teresa YHW,Peter P, Cheuk CS, et al.Association of plasminogen activator inhibitor-1 4G/4G genotype and type 2 diabetic nephropathy in Chinese patients[J].Kidney International,2000,57:632-638.

　　[4] Berger J,Hinglais N.Les depots intercapillaires d'IgA-IgG[J].J Urol Nephrol,1968，74:694-695.

　　[5] Li LS,Liu ZH.Epidemiologic data of renal diseases from a single unit in China:analysis based on 13,519 renal biopsies[J].Kidney Int,2004，66:920-923.

　　[6] 刘刚，马序竹，邹万忠，等.肾活检患者肾脏病构成十年对比分析[J].临床内科杂志，2004，21(12):45-49.

　　[7] Donadio J，Grande J，IgA nephropathy[J].N Engl J Med，2002,347(10)：738-748.

　　[8] 丁瑞，陈香美，刘述文，等.PAI-1基因4G4G基因型与IgA肾病易感性及临床表现的关系[J].中华医学遗传学杂志，2006，23(4)：449-451.

　　[9] Suzuki H,Sakuma Y,Kanesaki Y,et al.Close relationship of plasminogen activator inhibitor-1 4G/5G polymorphism and progression of IgA nephropathy[J].Clinical Nephrology,2004，62(3)：173-179.

　　[10] 于志恒,陈香美,廖洪军,等.纤溶酶原激活物抑制物-1基因转导对肾小球系膜细胞外基质积聚的影响[J].中华内科杂志,1999,38(8)：541-545.

　　[11] 李长贵,董砚虎,王海燕,等.PAI-1基因4G/5G多态性与2型糖尿病合并肾病的相关性研究[J].中国糖尿病杂志，2001，9(6)：333-340.

　　[12] Grandaliano G,Pontrellip,Cerullo G,et al.Protease activated receptor 2 expression inIgA nephropathy:a potential role in the pathogenesis of interstitial fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2003,14(8)：2072-2083.

　　[13] Hamano K,IwanoM,Akai Y,et al.Expression ofglomerular plasminogen activator inhibitor type-1 in glomerulonephritis[J].Am J Kidney Dis,2002,39(4)：695-705.

　　[14] Eddy AA.Plasminogen activator inhibitor-1 and the kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2002,283:F209-F220.

　　[15] 何立群.肖黎.纤溶酶原激活物抑制剂-1基因启动子区4G/5G多态性与IgA肾病肾小球硬化的相关性研究[J].上海医学,2003，26(11)：813-815.