维生素C对肝硬化门静脉高压症患者肠系膜微动脉收缩反应性的影响及其机制

肝硬化门静脉高压症 (portal hypertension, PHT)时,内脏动脉对血管收缩物质的低反应性是PHT高动力循环形成的关键因素。研究发现,PHT大鼠离体肠系膜微动脉和肝硬化 PHT患者的前臂动脉对去甲肾上腺素的反应性明显降低[1-2]。肝硬化PHT患者机体存在高氧化应激,血液中超氧阴离子和丙二醛 (malonaldehyde,MDA)水平明显 升高[3],血浆维生素C的浓度明显降低。静脉注射维生素C后能改善肝窦内皮细胞功能,肝内一氧化氮释放增加[4],也能逆转 PHT患者前臂动脉对去甲肾上腺素的低反应性[2],但机制不明。因此,我们将研究维生素C治疗后对肝硬化 PHT患者氧化应激水平和肠系膜动脉收缩反应性变化的影响,初步探讨其作用机制。

资料与方法

一、主要实验材料维生素 C针剂:规格为 2ml,1g,产 品批号为 100908,由 上海信谊金朱药业有限公司生产。兔抗 mocsin抗体、 抗磷酸化 moesin(p-moesin)(Thr558) 抗体由美国Santa Cruz公 司提供;免抗 ROCK-1抗体和抗 RhoA多 克隆抗体 由美 国 CellSingnahng Technology公司提供;MDA测定试剂盒由南京建成生物公司提供。

二、 研究方法

患 者分组:研究对象为2010年1月至2011年6月因乙肝后肝硬化PHT或非PHT患者因其他良性疾病在我院行手术治疗的患者。该研究得到我院伦理委员会批准。(1)非 PHT组 :共 6例 ,其中男4例,女2例,年龄 35~55岁。2例胆总管结石, 4例胆总管囊肿,行胆管-空肠 Roux-Y吻合。术前一般状况良好,2周 内未使用任何药物,术前肝功能和其他脏器功能均正常,术前 CT或 MRI检查、 术中探查肝脏形态均正常。(2)PHT组 :共 11例 ,均为乙肝后肝硬化 PHT患者,其中男 9例 ,女 2例 ,年龄 38~63岁,无心血管系统、 肺、 脑等重要脏器合并症,有呕血或黑便史,胃镜和螺旋 CT血管成像显示肝硬化,食管、 胃底静脉曲张,需择期行断流术或断流 +分流术。其中肝功能 Child-Pugh分级 A级为 6例,B级为 3例,C级为2例。术前 2周除部分患者服用抗乙型肝炎病毒药物外,未服用其他药物。采用随机数字表的方法将上述 H例患者分为维生素 C治疗组(简称治疗组)和安慰剂治疗组(简称安慰剂组),2组 患者的性别、 年龄构成和肝功能 Child-Pugh分级相比差异均无统计学意义。①治疗组(5例):手术前7d起给予维生素C注射液3.0g, 溶于 100m l生 理盐水注射液,静脉滴注15min结束,每天 1次。手术当天麻醉开始前 30min再次使用 1次 ,15min滴完,。45min后手术。参照以往的文献,上述维生素 C的剂量足够抑制血管壁活性氧的产生[2-4]. ②安慰剂组(6例 ):手术前 7d起给予 100ml生 理盐水注射液,静脉滴注 15min结 束,每天 1次.手术当天麻醉开始前 30min再使用 1次, 15min滴完,45min后手术。

血 浆 MDA的测定:所有患者入院后抽取 8ml血液,麻醉诱导开始前抽取 8ml血 液。血液离心后,取上清液置于液氮内保存。参照厂家说明书, 测定血浆 MDA浓度

术 中门静脉压力的测定:患者术中禁用血管活性药物,取出血管标本前用平衡液。术中控制心率在60 ~100次/血n,平均血压在 80~100mm Hg, 血氧饱和度在 98%以上。门静脉压力测定的方法参见文献[5]。

血管的获取:测定门静脉压力后,在距离十二指肠悬韧带约 1m处取空肠旁第三级肠系膜血管及其系膜,该操作不影响空肠局部血供。用平衡液冲洗清除血管内血块后,将标本分为两组,一组置人 MOP-SPSS液 (0~4℃ ,pH=7.4)中保存用于反应性测定,另一组抽出肠系膜动脉后置于液氮内保存用于分子生物学测定。

建立单根血管灌流系统和测定肠系膜微动脉对去甲肾上腺素的反应性:在解剖显微镜下锐性分离得到第三级肠系膜微动脉,并将微动脉两端固定于血管槽玻璃微管,其直径通过显微镜摄像系统显示于计算机显示屏上,用微动脉显像尺测定直径变化[1]。待血管稳定后,按 累积浓度法向血管槽中依次加入去甲肾上腺素(10-7~10-5mol/L),以 血管内径改变量(um)占血管最大直径(um)的百分比即收缩率为量化标准,绘制去甲肾上腺素的量-效曲线。以血管收缩率作为纵坐标,以去甲肾上腺素浓度的常用对数值作为横坐标,对 比剂量反应曲线的组间区别以及当收缩率达到 m%时所需要去甲肾上腺素的浓度值(EC50)。

RhoA、ROCK-1蛋白以及 moesin和 p-moesin 蛋白量的测定:应用 Westcm blotting法 分别检测肠系膜动脉的蛋白表达状况。以 β-actin为 内参照,采用美国 Kodak公 司ID数码成像分析系统软件对 Western blot结 果进行定量分析。灰度值以积分光密度值(IOD)表示.ROCK使 moesin氨基酸序列第 558位点的苏氨酸磷酸化,能通过特异性的抗体检出,由此可反应 ROCK活性的变化[6]。

三、 统计学处理采用 PSS16.0软 件包处理数据,多组间均数比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。肠系膜微动脉对去甲肾上腺素反应性的变化通过量-效 曲线表示,运 用非线性 回归法,采 用 Prism 计算机软件作出拟合曲线,并通过该曲线计算出EC50值 。

结 果

一、 血浆 MDA的测定结果如表 1所示,肝硬化 PHT患 者血浆 MDA值远高于非 PHT患者,经维生素 C治疗后,肝硬化患者血浆 MDA值明显降低(F=9.746,P<0.01)。

二、 术中门静脉压力的测定结果无论是否经过维生素 C治疗,肝硬化 PHT患者的术中门静脉压力无明显变化,均显著高于非肝硬化 PHT患者(F=42.95,P<0.01( 表2)。

三、 肠系膜微动脉对去甲肾上腺素反应性的变化与非PHT患者相比较,肝硬化PHT患者的离体肠系膜微动脉对去甲肾上腺素剂量反应曲线右移, EC50增大;经维生素 C治疗后,肝硬化 PHT患 者的离体肠系膜微动脉反应曲线左移,EC50降低(P< 0.01)(图1,表 3)。

四、 肠系膜动脉 RhoA/ROCK通路相关蛋白量和活性的变化通过Western blot分析,我们发现无论是非PHT患者,还是肝硬化 PHT患者或经过维生素 C治疗,其肠系膜动脉 RhoA蛋 白量都无明显变化(P> 0.05);与非 PHT患 者相比,肝硬化 PHT患者肠系膜动脉ROCK-1和 p-moesin蛋 白量均降低 (P< 0.01),moesin蛋白量不变;经维生素 C治疗后,肠系膜动脉的 ROCK-1蛋 白量和活性均升高 (P< 0.01)(图2)。

讨 论

本研究发现大剂量抗氧化剂维生素 C不但能降低肝硬化 PHT患者的氧化应激水平,也提高了肝硬化 PHT患者肠系膜微动脉对外源性去甲肾上腺素 的反应性。 肝硬化PHT患者处于高氧化应激状态,而且血浆中维生素 C的含量远比正常人低,血浆维生素 C浓度的高低可以反应机体的氧化应激状态[2-4]. 维生素 C是活性氧的有效清除剂,静脉注射维生素 C后,能降低 MDA在体内的浓度。另外,通过对健康志愿者的研究发现,维生素 C不会影响去甲肾上腺素诱导的血管收缩[7],排除了本研究中维生素 C对血管收缩剂的直接影响。

虽然肝硬化 PHT患 者血循环中缩血管物质是增加的,但是内脏和外周动脉的收缩低反应性却是普遍现象。一般来说,血管活性的改变受到许多因素的调节,但磷酸化的肌球蛋白轻链和非磷酸化的肌球蛋 白轻链之间的平衡起到决定性的作用。 RhoA/ROCK信号通路是血管平滑肌收缩调节的一个重要因素,能使平滑肌的收缩进一步增强[8]。 既往研究发现在肝硬化患者血管中收缩激动剂受体和它们相关的 G蛋白含量并没有下降[9]。我们的研究结果提示肝硬化 PHT患者内脏动脉对缩血管物质存在低反应性,其原因与RhoA/ROCK通 路中某些信号的缺失有关。

在本研究中,我们发现肝硬化 PHT患者血管平滑肌 RhoA/ROCK通路中ROCK的蛋白量和活性明显下降,这就造成了肌球蛋白轻链磷酸酶的活性不能受到抑制,去磷酸化的肌球蛋白轻链比例增多,平滑肌的收缩能力下降。通过维生素 C治疗,能使 ROCK的蛋白量和活性均上升,改善了平滑肌的收缩功能。血管平滑肌的收缩主要通过磷脂酶 C通路和 RhoA/ROCK通路,虽 然对磷脂酶 C通路在本研究中未涉及,但是增加维生素 C浓度的确能提高 RhoA/ROCK通路中关键酶——ROCK的量和活性, 改善平滑肌的收缩功能,也说明 RhoA/ROCK通 路在维持平滑肌的收缩中起到重要作用[10]。总之,我们的研究结果显示静脉注射大剂量的维生素 C改善了肝硬化 PHT患者氧化应激状态,也改善了肠系膜动脉对去 甲肾上腺素收缩的低反应性 ,其机制与提高了 ROCK蛋 白量和活性有关。

参考文献

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