醛固酮合酶CYP11B2（344C/T）基因多态性与2型糖尿病肾病的相关性

　　作者：冯传首，王云英，王培林，崔玉忠 作者单位：青岛大学附属市立医院，山东 青岛 266011

　　【摘要】 目的 探讨醛固酮合酶CYP11B2(344C/T)基因多态性与2型糖尿病肾病的关系。方法 采用聚合酶链反应限制性酶切片段长度多态性分析(PCRRFLP)技术检测95例2型糖尿病患者(其中合并肾病患者32例,未发生肾病63例)和175例健康对照组醛固酮合酶CYP11B2(344C/T)基因多态性。结果 糖尿病肾病组、糖尿病非肾病组和健康对照组两两比较，CYP11B2基因型和等位基因分布均无统计学差异(P>0.05)。与健康对照组比较，糖尿病肾病组和糖尿病非肾病组的血浆醛固酮水平均有极明显增高(P<0.01);糖尿病肾病患者CYP11B2(344C/T)基因多态性的3种基因型间血浆醛固酮水平比较差异有显著性(P<0.05)。结论 醛固酮合酶CYP11B2(344C/T)基因多态性与2型糖尿病肾病的发生无显著相关性，但可能与血浆醛固酮水平有关。

　　【关键词】 2型糖尿病,糖尿病肾病,醛固酮合酶; 基因多态性

　　肾素血管紧张素醛固酮系统(reninangiotensinaldosterone system，RAAS)对糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发生、发展有重要影响，其中醛固酮合酶CYP11B2基因越来越受到关注，但因种族和环境不同,国内外对此尚有争论，因此，我们对青岛地区汉族人群中CYP11B2(344C/T)基因多态性与2型DN的关系进行研究，以探讨其相关性。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象

　　在青岛市立医院选取诊断明确的2型糖尿病患者95例，其诊断和分型依照1999年WHO糖尿病诊断标准。全部患者均进行尿微量白蛋白检查，肾脏病变的判断标准为尿白蛋白排泄率>20 μg/min(放免法)。肾功能异常即为糖尿病肾病组(DN组)，共计32例，男10例，女22例，其余为糖尿病非肾病组(DM组)，共计63例,男28例，女35例。另随机抽取175例(男66例，女109例)健康人作为对照组。对选定的对象进行调查，内容包括年龄、性别、病史及并发症史、吸烟与饮酒史，测量血压、身高、体重、腰臀比值(WHR)、血糖、血清总胆固醇(TC)、高密度和低密度脂蛋白胆固醇(HDLC，LDLC)、甘油三酯(TG)等。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 基因多态性研究 (1)标本的采集：对合格样本经知情同意后，抽取外周静脉血5 ml，试管中加入肝素抗凝，立即置4℃保存。(2)基因组DNA的提取：采用DNA Blood Mini Kit(基因公司)。(3)引物的合成： 参照GenBank醛固酮合酶CYP11B2(344C/T)基因序列数据库资料及Kupari等的文献[1]设计引物，由上海生工公司合成。上游序列： 5′ CAGGAGGAGACCCCATGTGAC3′下游序列： 5′ CCTCCACCCTGTTCAGCCC3′(4)目的基因扩增：PCR反应体系30 μl，含10×Buffer 3 μl，25 mol/L的MgCl21.2 μl，10 mmol/L dNTP 0.6 μl，上下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶1 U，水22.2 μl， DNA模板1 μl。扩增条件：94℃预变性5 min，进入94℃变性60 s，68℃退火60 s，72℃延伸60 s循环35个周期，最后72℃延伸5 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳EB染色观察。(5)基因型检测：限制性内切酶反应体系30 μl，含PCR扩增产物10 μl，Hae111内切酶10 U，10×Buffer 3 μl，水16 μl，于37℃酶切2 h。产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳(70V)40 min，用GolDoc2000观察并照像。

　　1.2.2 血浆(立位)醛固酮水平 采用常规放免法检测。

　　1.3 统计学处理

　　用SPSS10.0统计软件对资料进行统计学分析，各临床参数，多组间定量资料比较采用成组设计单因素方差分析，两两比较采用q检验，两个均数比较采用t检验，计算数据结果用均数±标准差(±s)表示，对群体数据作HardyWeinberg平衡吻合度检验，基因型及等位基因频率分布采用χ2检验，，以P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　CYP11B2基因在转录调节区344位点变异，发生胸腺嘧啶(T)与胞嘧啶(C)的互换[3]，即T344C。344C等位基因有HaeⅢ酶切位点，而344T等位基因无该酶切位点，所以，TT型酶切片段为273 bp，CC型为202 bp， CT型为273 bp和202 bp片段。

　　2.1 一般特征比较

　　DN组、DM组和对照组之间性别匹配，其一般情况见表1，一般生化特征见表2，各项指标在3组间的差异均无显著意义(P>0.05)。

　　2.2 基因多态性分析

　　DN组、DM组和对照组的3种基因型频率和T、C等位基因频率见表3，经吻合度检验符合HardyWeinberg平衡，表明样本具有群体代表性。3组间基因型和等位基因分布无统计学差异(χ2=2.895，P>0.05;χ2=2.481，P>0.05)。DN组、DM组分别与对照组比较，其基因型分布无统计学差异(χ2=1.724，P>0.05;χ2=1.768，P>0.05)，等位基因T、C分布也无统计学差异(χ2=1.524，P>0.05;χ2=1.509，P>0.05)。DN组与DM组比较，其基因型分布无统计学差异(χ2=0.080，P>0.05)，等位基因T、C分布也无统计学差异(χ2=0.062,P>0.05)。

　　2.3 血浆(立位)醛固酮水平比较

　　DN组、DM组和对照组3组间血浆(立位)醛固酮水平有统计学差异(F=24.82,P<0.01)，DN组，DM组分别与对照组比较，其血浆(立位)醛固酮水平均有极明显增高[(329.28±39.52)pmol/L vs.(286.96±37.58)pmol/L，q=7.983，P<0.01;(317.16±42.47) pmol/L vs.( 286.96±37.58)pmol/L，q=7.455，P<0.01)]。DN组与DM组相比较则无明显变化[(329.28±39.52)pmol/L vs. (317.16±42.47)pmol/L，q=2.025，P>0.05]。DN组3种基因型间血浆(立位)醛固酮比较：与携带TT基因型DN患者相比，携带CT或CC基因型DN患者其水平明显增高[(338.32±27.84)pmol/L vs. (314.21±31.44)pmol/L，t=2.260，P<0.05)]。表1 各组一般情况比较表2 各组一般生化特征比较 表3 各组基因型和等位基因分布情况

　　3 讨论

　　醛固酮合酶基因定位于第8号染色体上(8q22)[2]，全长约7 kb，含8个内含子和9个外显子。在我国汉族人群中，TT基因型以及CT基因型占优势，C等位基因稀少，其分布在不同性别间无统计学差异[4,5]。

　　本研究中，CYP11B2(344C/T)基因多态性与2型糖尿病以及DN的发生无明显相关性，但可能与血浆醛固酮水平有关。不过，由于该研究中样本量偏小(n=32例)，有待扩大样本量进一步研究。在CYP11B2(344C/T)基因多态性的研究中，发现不同基因型人群的醛固酮水平不同，Lpojoga等[6]证明CYP11B2(344C/T)基因多态性C等位基因与血浆醛固酮水平明显相关，王蕊等[7]研究发现血浆醛固酮水平在CYP11B2基因344C/T的3个不同基因型间比较差异有极明显，以上研究结果与本文研究相同。目前，对344C/T多态性与2型糖尿病肾病关系的看法不一，相关研究不多。Prasad等[8]研究发现CYP11B2(344C/T)基因多态性与2型糖尿病肾病有关，Lajer等[9]则认为在糖尿病中，344C/T多态性与DN不相关，只与血压变化有关。目前国内尚无其他相关报道，其相关性有待进一步证实。

　　【参考文献】

　　[1]Kupari M,Hautanen A,Lankinen L,et al.Association between human aldosterone synthase(CYP11B2) gene polymorphisms and left ventricular size,mass,and function [J].Circulation,1998,97: 569575.

　　[2]Curnow KM,Tusie L,Pascoeuna MtL,et al. The product of the CYP11B2 gene is required for aldosterone biosynthesis in the human adrenalcortex [J].Mol Endocrinol,1991,5:15131522.

　　[3]Mulatero P, Schiavone D, Fallo F, et al.CYP11B2 gene polymorphisms in idiopathic hyperaldosteronism [J].Hypertension,2000,35:694698.

　　[4]胡晓军,王 蕊,王 芳,等.汉族人群醛固酮合酶基因344 C/T多态性的研究[J].微循环学,2003,13:2627.

　　[5]陈爱华,张文秀, 晓唐明,等. 醛固酮合成酶基因多态性与高血压及左室肥厚的关系[J].中华内科杂志,2002,41:99103.

　　[6]Lpojoga l, Gautier S, Blanc H, et al. Genetic determination of plasma aldosterone levels in essential hypertension [J]. Am J Hypertens,1998,119:856860.

　　[7]王 蕊,王晋明 ,谢忆山,等.醛固酮合酶基因多态性与原发性高血压及血浆醛固酮水平的关系 [J].临床内科杂志,2004,21:524526.

　　[8]Prasad P, Tiwari AK,Kumar KM,et al.Chronic renal insufficiency among Asian Indians with type 2 diabetes:I. Role of RAAS gene polymorphisms [J]. BMC Med Genet，2006,5:3742.

　　[9]Lajer M,Schjoedt KJ,Jacobsen P, et al.Aldosteronesynthase(CYP11B2)344T/C polumorphism is not associated with the initiation and progression of diabetic nephropathy in Caucasian Type 1 diabetic patients[J].Diabetes.2006,23:7580.