人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

　　作者：李晓永　　作者单位：上海交通大学医学院新华医院内分泌科，上海 200092

　　【摘要】目的 克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法 以人甲状腺组织cDNA为模板，聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列，克隆入pGEMT载体中，经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后，定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，并进行双酶切鉴定。结果 PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp，以此构建的pGEMThTSHR克隆载体，经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段，重组质粒pcDNA3.1hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带，DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致，证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论 成功构建了野生型pcDNA3.1hTSHR重组真核表达载体。

　　【关键词】 甲状腺刺激激素受体,克隆,真核表达载体

　　Abstract: Objective To clone human thyroid stimulating hormone receptor(hTSHR) gene and construct its eukaryotic expression vector.Methods The whole coding sequence of hTSHR gene was amplified by polymerase chain reaction ( PCR) applied with human thyroid cDNA.The fragment was inserted into cloning vector pGEMT and the recombinant pGEMThTSHR was identified by double digestion with restriction enzymes and sequencing.The hTSHR cDNA fragment was subcloned into pcDNA3.1 plasmid.The recombinant pcDNA3.1hTSHR was identified by double digestion with restriction enzymes and sequencing.Results The length of the specific fragment by PCR was 2337bp,and the pGEMThTSHR plasmid was identified by the same way.The sequence was identical to that of hTSHR cDNA in GenBank.The recombinant pcDNA3.1hTSHR plasmid was separated into two bands,approximately 5 100 kb and 2300bp,by using respective restriction enzymes KpnⅠand XbaⅠ,and the sequence was identical to that of hTSHR cDNA in GenBank,suggesting that hTSHR gene fragment had been cloned into pcDNA3.1 vector correctly.Conclusion The wildtype recombinant eukaryon expression vector pcDNA3.1hTSHR was successfully constructed.

　　Key words: thyroid stimulating hormone receptor;clone;eukaryon expression vector

　　甲状腺刺激激素(thyroid stimulating hormone,TSH) 也称促甲状腺激素(thyrotrophin)，是垂体前叶分泌的一种重要的糖蛋白激素，其通过特异的TSH受体(TSH receptor,TSHR)发挥促甲状腺作用。研究发现，TSHR不仅介导TSH的生理作用，而且也是一种重要的自身抗原，在自身免疫性甲状腺疾病的发生发展中具有重要意义[12]。本研究克隆了人TSHR(human TSHR，hTSHR)全长cDNA，并构建真核表达载体，为TSHR的进一步研究及对其抗体异质性的检测打下了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 RNA抽提试剂Trizol和pcDNA3.1质粒购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒、Pfu DNA聚合酶、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂、pGEMT载体和T4 DNA连接酶均购自Promega公司;凝胶回收试剂盒和质粒小抽试剂盒购自Qiagen公司;DNA分子量标准购自TaKaRa公司;限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ购自New England Biolabs，PCR扩增引物由上海生工公司合成。

　　1.2 甲状腺组织总RNA抽提 人甲状腺组织取自外科手术切除的标本，取约0.5 g甲状腺组织，立即置液氮中。将甲状腺组织置液氮中研碎，以Trizol抽提总RNA，紫外分光光度仪测定浓度和纯度。

　　1.3 hTSHR全长cDNA的克隆及鉴定 取甲状腺组织总RNA 2 g，以Oligo(dT)15为引物进行cDNA第1链的合成。根据GenBank中hTSHR基因的cDNA序列(GenBank登陆号：M32215)，选用Primer 5.0软件设计上下游引物，并分别在上下游引物中嵌入限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ的酶切位点。上游引物为：5′cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA3′(方框内为KpnⅠ酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列)，下游引物为：5′cct cta gac gcc cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC3′(方框内为XbaⅠ酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列)，扩增片断长度为2 337 bp。以人甲状腺组织cDNA第1链为模板于PerkinElmerCetus 9700热循环仪上进行PCR反应，反应体系：cDNA 1 μL，10×Buffer 5 μL，10 μmol•L-1上下游引物各1 μL，2.5 mmol•L-1 dNTP 4 μL，Pfu DNA聚合酶0.5 μL，补双蒸水至50 μL。PCR 反应采用Touchdown法，反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火温度在起始的10个循环中为60 ℃～55 ℃，每次递减0.5 ℃，退火时间为45 s，72 ℃延伸4 min;在以后30个循环中，退火温度固定为55 ℃，退火时间为45 s，72 ℃延伸4 min;最后于72 ℃延伸10 min。PCR产物于12 g•L-1琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取含有目的条带的琼脂糖凝胶块，按凝胶回收试剂盒说明书回收胶块中的目的DNA。

　　将纯化后的目的片断与pGEMT载体在T4 DNA连接酶作用下，于4 ℃连接过夜。取上述连接产物10 μL转化处于感受态的大肠杆菌DH5α，将转化后的DH5α涂布于含100 mg•L-1氨苄青霉素及XGal、异丙基βD硫代半乳糖苷的LB平板上，用蓝白斑法筛选阳性克隆。37 ℃培养16 h后，挑取白色菌落，扩大培养后提取质粒DNA，以KpnⅠ/XbaⅠ双酶切鉴定。鉴定正确的质粒送交上海博亚生物技术有限公司进行DNA序列测定，并将测序结果与GenBank中的hTSHR cDNA 序列进行比对。

　　1.4 hTSHR真核表达载体的构建及鉴定 将测序正确的pGEMThTSHR重组质粒用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切，回收hTSHR cDNA片段，并与经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切的真核表达载体pcDNA3.1进行连接反应，用连接产物转化处于感受态的大肠杆菌DH5α，挑取含氨苄青霉素抗性的阳性克隆，扩大培养后按质粒提取试剂盒说明书提取质粒，以KpnⅠ/XbaⅠ双酶切鉴定，并再次测序。

　　2 结果

　　2.1 hTSHR基因cDNA的PCR扩增 以人甲状腺组织cDNA为模板，以hTSHR基因特异的引物进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳可见1条约2 300 bp的特异性条带(图1)，与预期的2 337 bp目的基因片段大小接近，说明扩增所得的条带是预期的目的基因片段。

　　2.2 pGEMThTSHR克隆载体的构建及鉴定 目的片断与pGEMT载体连接后采用蓝白斑法筛选阳性克隆，阳性克隆扩大培养后提取质粒DNA，以KpnⅠ和XbaⅠ作双酶切，电泳可见2个条带，其中1个条带约为2 300 bp左右。测序结果经Blast分析，显示与GenBank中的人hTSHR基因cDNA序列完全一致。

　　2.3 hTSHR真核表达载体的构建及鉴定 将经测序证实的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切片段连接入pcDNA3.1的KpnⅠ/XbaⅠ酶切位点之间，构建成pcDNA3.1hTSHR重组质粒。筛选后挑取阳性克隆，扩大培养，抽提质粒DNA，以KpnⅠ和XbaⅠ作双酶切，酶切产物电泳后可见2条条带，其大小分别为5 100 bp和2 300 bp 左右(图2)，说明目的基因已克隆入pcDNA3.1。测序结果(图3)显示，克隆入pcDNA3.1的目的片段与hTSHR基因的编码区序列完全一致，进一步证明pcDNA3.1hTSHR真核表达载体已构建成功。

　　3 讨论

　　TSHR在自身免疫性甲状腺疾病的发生中具有重要的作用。当免疫功能紊乱时，机体可产生针对TSH受体的自身抗体即TSH受体抗体。TSH受体抗体同TSHR结合后可使甲状腺滤泡上皮细胞产生一系列变化，从而导致自身免疫性甲状腺疾病。研究发现，TSH受体抗体具有异质性：有些TSH受体抗体和TSHR结合后发挥类似TSH的作用(刺激cAMP产生、摄碘及甲状腺球蛋白合成)，称为甲状腺刺激性抗体(thyroid stimulating antibodies,TSAb);有些TSH受体抗体同TSH受体结合后抑制TSH介导的受体活化，称为甲状腺刺激阻断性抗体(thyroid stimulationblocking antibody,TSBAb);还有一些TSH受体抗体同TSH受体结合后既无刺激作用也无抑制作用，称为中性TSH受体抗体(neutral TSH receptor antibodies)[35]。一般认为，如果TSH受体抗体以TSAb为主，临床上表现为Graves病，如果以TSBAb为主，临床上则表现为原发性甲状腺功能减退症。

　　鉴于TSH受体抗体的异质性在自身免疫性甲状腺疾病发病中的作用，区分TSH受体抗体的功能便具有重要的临床意义。但目前临床上常用的方法为体外竞争受体法，这种方法是以待测血清与125I标记的TSH竞争结合TSH受体制剂，根据竞争的强弱判断待测血清TSH受体抗体水平。上述方法的基础是TSH受体抗体可与TSH受体结合并能将标记的TSH从受体上置换下来，因此用这种方法测定的TSH受体抗体也称为TSH结合抑制免疫球蛋白(TSH binding inhibiting immunoglobulins,TBII)[6]。TBII的主要缺点是只能反映抗体与TSH竞争TSH受体的能力，不能区分抗体的功能是刺激性还是阻断性。

　　1958年著名学者McKenzie[7]建立了McKenzie生物分析法，用以测定LATS(相当于现在所称的TSH受体抗体)，该方法的缺点是不仅需要实验动物，费时费力，且敏感性差。此后有人采用FRTL5细胞为材料进行TSH受体抗体的功能测定，即体外细胞生物法，但FRTL5细胞的培养条件很苛刻，而且存在种属差异，测定的敏感性也不高[1]。随着人TSH受体的克隆，Vassart等[89]将人TSH受体cDNA克隆到pSVL真核表达载体中，并将此载体转染到CHO细胞并筛选合适的稳定表达细胞，得到1株适于TSAb和TSBAb测定的细胞，称为JP26细胞。JP26细胞较FRTL5细胞有很多优点，是目前国际上最常用的用于测定TSAb和TSBAb的细胞[10]。

　　国内由于缺乏高效稳定表达人TSH受体cDNA的细胞株，致使TSAb和TSBAb的测定难以开展，极大地阻碍了自身免疫性甲状腺疾病的诊断、治疗和研究。有鉴于此，本实验采用RTPCR技术克隆了人TSH受体全长cDNA，并将其连接到质粒pcDNA3.1,构建了真核表达载体。pcDNA3.1具有转染效率高、便于筛选等优点，是应用非常广泛的真核表达载体。作者拟在本研究的基础上，将构建的pcDNA3.1hTSHR表达载体转染CHO细胞并筛选稳定转染的细胞株，以建立TSAb和TSBAb的测定方法。

　　总之，本研究克隆了hTSHR全长cDNA并构建了pcDNA3.1hTSHR真核表达载体，为TSAb和TSBAb的测定奠定了基础，也为进一步研究人TSH受体的结构和功能打下了基础。

　　【参考文献】

　　[1] 葛勤敏，苏 青.促甲状腺激素受体抗体及其临床意义[J].上海交通大学学报：医学版，2006，26(suppl):15.

　　[2] 葛勤敏，苏 青.促甲状腺激素受体的裂解和脱落[J].上海交通大学学报：医学版,2007，27(3):354356.

　　[3] Rapoport B,Chazenbalk GD,Jaume JC,et al.The thyrotropin (TSH) receptor:interaction with TSH and autoantibodies[J].Endocr Rev，1998,19(6):673716.

　　[4] Kohn LD,Harii N.Thyrotropin receptor autoantibodies(TSHRAbs):epitopes,origins and clinical significance[J].Autoimmunity,2003,36(67):331337.

　　[5] Prabhakar BS,Bahn RS,Smith TJ.Current perspective on the pathogenesis of Graves disease and ophthalmopathy[J].Endocr Rev,2003,24(6):802835.

　　[6] Morgenthaler NG,Nagata A,Katayama S,et al.Detection of low titre TBII in patients with Graves′ disease using recombinant human TSH receptor[J].Clin Endocrinl,2002,57(2):193198.

　　[7] McKenzie JM.Delayed thyroid response to serum from thyrotoxic patients[J].Endocrinology,1958,63(6):865868.

　　[8] Ludgate M,Perret J,Parmentier M,et al.Use of the recombinant human thyrotropin receptor (TSHR) expressed in mammalian cell lines to assay TSHR autoantibodies[J].Mol Cell Endocrinol,1990,73(1):R13R18.

　　[9] Perret J,Ludgate M,Libert F,et al.Stable expression of the human TSH receptor in CHO cells and characterization of differentially expressing clones[J].Biochem Biophys Res Commun,1990,171(3):10441050.

　　[10] Massart C,Gibassier J,Verite F,et al.Use of Chinese hamster ovary cell lines transfected with cloned human thyrotropin receptor for the measurement of thyroidstimulating antibodies:advantages and difficulties[J].Clin Chim Acta,2000,291(1):6781.