核因子－κＢ对ＴＮＦ-α诱导的脂肪细胞葡萄糖转运蛋白４表达的影响

　　作者：林晓仪,郭颖,丁鹤林,傅祖植　　作者单位：1.中山大学附属中山医院内分泌科， 广东 中山 528400; 2.中山大学附属第二医院内分泌科， 广东 广州 510120

　　【摘要】【目的】 观察TNF-α对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白4(GLUT4) mRNA与蛋白表达的作用，并探讨核因子-κB(NF-κB)对上述作用的影响。【方法】 成熟的3T3-L1脂肪细胞分成3组：A组正常对照组，B组肿瘤坏死因子α(TNF-α)组，C组吡咯烷二硫基甲酸酯(NF-κB活性抑制剂) + TNF-α组。各组干预48 h后检测phospho- NF-κB p65(Ser536)的蛋白水平、GLUT4 mRNA及蛋白水平。蛋白检测采用Western法，mRNA检测采用RT-PCR法。【结果】 B组phospho- NF-κB p65蛋白水平(71.1 ± 5.9)高于A组(41.3 ± 1.7， P < 0.001)和C组(25.4 ± 4.7， P < 0.001)。B组GLUT4的mRNA水平(0.86 ± 0.14， P < 0.001)与蛋白水平(31.6 ± 7.2， P < 0.001)低于A组(2.01 ± 0.65; 60.7 ± 8.4)，C组mRNA水平(0.46 ± 0.12)与B组比较有下降趋势但无统计学意义(P = 0.100)，C组蛋白水平(9.5 ± 3.0)低于B组(P = 0.001)。【结论】 TNF-α下调3T3-L1脂肪细胞的GLUT4表达，抑制NF-κB活性后GLUT4表达进一步下调。这提示了TNF-α可能不是通过激活NF-κB而使GLUT4的表达下调。

　　【关键词】 核因子-κB,肿瘤坏死因子-α,3T3-L1脂肪细胞,葡萄糖转运蛋白4

　　Abstract： 【Objective】 To observe the regulating actions of tumor necrosis factor-α (TNF-α) on the mRNA and protein expression of glucose transporter 4 (GLUT4) in 3T3-L1 adipocytes， and to investigate the effects of nuclear factor kappa B (NF-κB) on these actions. 【Methods】 The fully differentiated 3T3-L1 adipocytes were divided into three groups. Group A was the control group. Group B was treated with TNF-α. Group C was treated with pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC， an inhibitor of NF-κB activity) and TNF-α. After the adipocytes were treated for 48 h， the protein expression of phospho-NF-κB p65 (Ser536) and GLUT4 were tested by Western blot， and mRNA expression of GLUT4 was tested by RT-PCR. 【Results】 The phospho-NF-κB p65 protein expression in group B (71.1 ± 5.9) was significantly higher than those in group A (41.3 ± 1.7， P < 0.001) and in group C (25.4 ± 4.7， P < 0.001). The expression of the GLUT4 mRNA (0.86 ± 0.14， P < 0.001) and protein (31.6 ± 7.2， P < 0.001) in group B were significantly lower than those in group A (2.01 ± 0.65; 60.7 ± 8.4). Though the GLUT4 mRNA expression in group C (0.46 ± 0.12) was decreasing compared with that in Group B， there was no statistical significance between them (P = 0.100). The GLUT4 protein (9.5 ± 3.0) expression in group C was significantly lower than that in group B (P = 0.001). 【Conclusion】 In 3T3-L1 adipocytes， GLUT4 expression is down-regulated by TNF-α， and down-regulated more by inhibiting NF-κB activity. This indicates that TNF-α may down-regulate the expression of GLUT4 not by activating NF-κB.

　　Key words： nuclear factor-κB; tumor necrosis factor-α; 3T3-L1 adipocyte; glucose transporter 4

　　肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)是重要的脂肪细胞因子，它通过抑制葡萄糖转运蛋白4 (glucose transporter 4， GLUT4)的表达和跨膜转运等途径，参与胰岛素抵抗的发病机制[1-2]。TNF-α是核因子-κB (nuclear factor kappa B，NF-κB) 重要的激活剂，而且TNF-α对脂肪细胞基因的表达大部分是通过NF-κB来调节的[3]。核因子-κB (nuclear factor kappa B， NF-κB)是独特的核转录因子，广泛存在于高级真核生物的各种细胞中，调节多种细胞因子和功能蛋白等的表达，与多种脂肪细胞基因的转录有关[3]，参与脂肪细胞的炎症[4]、分化[5]和凋亡[6]等细胞反应。因此，本研究观察TNF-α对3T3-L1脂肪细胞的GLUT4表达的影响，并以NF-κB抑制剂吡咯烷二硫基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate， PDTC)抑制NF-κB的活性，探讨NF-κB对上述作用的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞培养

　　取第3 ～ 6代3T3-L1前脂肪细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)进行实验。参照Stephens等[6]的方法进行3T3-L1前脂肪细胞培养及诱导分化。分化成熟的脂肪细胞进行油红O染色细胞鉴定。将细胞分为3组：A组为对照组;B组为TNF-α(5 nmol/L)组;C组为PDTC + TNF-α组，PDTC(100 ?滋mol/L)处理30 min后换用TNF-α(5 nmol/L)。成熟3T3-L1脂肪细胞用DMEM培养液(D-葡萄糖浓度为5.6 mmol/L、10 mL/L胎牛血清)同步化24 h，然后分组干预48 h，每24 h换相应培养液(DMEM D-葡萄糖25 mmol/L、100 mL/L胎牛血清)。

　　1.2 NF-κB活性检测

　　采用蛋白印迹法(Western blot)半定量测定Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (cell signaling tech-nology， 65 ku)蛋白水平反映NF-κB活性，以β-actin (NeoMarker， 42 ku)为内参照(n = 4)。

　　1.2.1 提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量 采用上海申能博彩生物科技有限公司BCA蛋白定量试剂盒，严格按照说明书操作。

　　1.2.2 Western blot检测Phospho-NF-κB p65 (Ser536) SDS-PAGE分离总蛋白，并转移至硝酸纤维素膜，封闭液室温封闭3 h，Phospho-NF-κB p65(Ser536)一抗(1：1 000) 4 ℃封闭过夜，HRP标记的特异性二抗(1：2 000)室温下孵育1 h，采用ECL化学发光试剂(cell signaling technology)对X光片曝光。以β-actin作为内参照。

　　1.2.3 AlphaImager 2200软件分析电泳条带感光密度 以Phospho-NF-κB p65(Ser536)/β-actin比值代表Phospho-NF-κB p65(Ser536)蛋白表达量。

　　1.3 RT-PCR检测GLUT4 mRNA含量

　　1.3.1 引物设计 以Primer5.0软件设计引物。GLUT4引物序列为：上游序列，5′-GCCCGAAAGA GTCTAAAGC-3′;下游序列，5′-AGAGCCACGGTCA TCAAG-3′，扩增产物为395 bp。β-actin引物序列为：上游序列，5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′;下游序列，5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′，扩增产物为218 bp(n = 6)。

　　1.3.2 逆转录(reverse transcription， RT)反应 提取细胞总RNA，25 μL反应混合物中含总RNA 5 μL、随机引物2 μL、5 × 逆转录缓冲液5 μL、dNTPmix(各10 mmol/L) 5 μL、RNA酶抑制剂(40 U/μL) 0.5 μL、MMLV 1 μL (Promega，200 U/μL)，加灭菌DEPC溶液(1 mL/L)至25 μL体积。反应混合物37 ℃反应60 min，然后以95 ℃反应5 min以灭活MMLV，产物用作PCR。以β-actin为内参照。

　　1.3.3 PCR 49.75 μL反应混合物中含RT产物5 μL、10 × PCR缓冲液(含Mg2+)5 μL、dNTP(各2.5 mmol/L) 4 μL、引物(含上、下游各20 μmol/L)2 μL，加灭菌三蒸水至49.75 μL。95 ℃预变性5 min后，向反应体系中加入Taq酶0.25 μL(TaKaRa， 5 U/μL)。反应参数：94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共34个循环，末次循环后72 ℃延伸10 min。

　　1.3.4 PCR产物的半定量 PCR产物4 μL，与6 × 核酸上样缓冲液和SYBR GreenⅠ染料(Molecular probes) 1 μL混匀，置20 g/L琼脂糖电泳，以AlphaImager 2200软件分析电泳条带感光密度，以GLUT4/β-actin比值代表GLUT4 mRNA表达量。

　　1.4 GLUT4蛋白水平测定

　　方法同Phospho-NF-κB p65 (Ser536)，以GLUT4 (Santa Cruz， 61kDa)/β-actin比值代表GLUT4蛋白表达量n = 6)。

　　1.5 统计学分析

　　采用单因素方差分析及两组间最小有意义差异(least significant difference， LSD) t检验。非正态分布资料经正态转换后再作统计学处理。

　　2 结 果

　　2.1 3T3-L1脂肪细胞鉴定

　　3T3-L1前脂肪细胞呈多角形或长梭形，胞浆内未见红色脂滴，细胞核圆形居中呈淡蓝色(图1)。分化成熟的3T3-L1脂肪细胞呈圆形或椭圆形，细胞浆内可见经油红O染成红色的脂滴聚集，部分细胞内可见脂滴融合现象，细胞核淡蓝色呈圆形、位于细胞一侧(图2)。

　　2.2 NF-κB活性变化

　　B组的Phospho-NF-κB p65蛋白水平高于A组(P < 0.001);C组的Phospho-NF-κB p65蛋白水平低于A组(P = 0.001);C组的Phospho-NF-κB p65蛋白水平低于B组(P < 0.001，表1，图3)。

　　2.3 3T3-L1脂肪细胞GLUT4 mRNA和蛋白表达的变化

　　B 组的GLUT4 mRNA水平低于A组(P < 0.001);C组与B组比较，C组的GLUT4 mRNA有下降的趋势但差别无统计学意义(P = 0.100，表1，图4)。B组的GLUT4蛋白水平低于A组(P < 0.001);C组的GLUT4蛋白水平低于B组(P = 0.001，表1，图5)。

　　3 讨 论

　　近年来脂肪源性细胞因子在胰岛素抵抗发病机制中的作用受到极大的关注[1，8]。TNF-α是重要的脂肪源性细胞因子，它在肥胖动物模型及肥胖患者中均过度表达，在体外培养细胞及体内均能诱导胰岛素抵抗的发生[1]。TNF-α引起脂肪细胞或组织胰岛素抵抗的机制尚未完全清楚。

　　目前的研究显示TNF-α通过抑制胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1， IRS-1)的酪氨酸残基磷酸化[9-10]，抑制糖原合成酶、脂蛋白酯酶等影响胰岛素敏感性的基因的表达[3]，促进游离脂肪酸的释放[11]等，从而引起胰岛素抵抗。葡萄糖转运是周围组织葡萄糖利用的主要限速步骤，胰岛素刺激葡萄糖转运的能力下降在胰岛素抵抗中起着主导作用。TNF-α对GLUT4表达和跨膜转运的抑制是它引起脂肪组织胰岛素抵抗的又一重要的机制。Stephens等[7]学者的一系列研究显示，在3T3-L1脂肪细胞中，TNF-α不仅能使GLUT4的mRNA水平下降，而且使GLUT4总蛋白以及细胞膜上分布呈时间和剂量依赖性的下降，胰岛素刺激的葡萄糖摄取降低。本研究结果也显示，在3T3-L1脂肪细胞中，TNF-α在转录和翻译水平均抑制GLUT4的表达。

　　TNF-α对GLUT4的具体调节作用机制尚未完全清楚。TNF-α是活化的单核巨噬细胞分泌的一种多功能细胞因子，它通过p38 丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)、p44/p42 MAPK、c-Jun氨基末端激酶/应激激活蛋白激酶(c-Jun-N-terminal protein kinase/stress activated protein kinase， JNK/SAPK)、酸性鞘磷脂酶-神经酰胺(acid sphingomyelinase-ceramide， SMase-ceramide)、蛋白激酶C(protein kinase C， PKC)以及NF-κB诱导激酶(nuclear factor kappa B inducible kinase-NF-κB， NIK-NF-κB)等信号通路调节细胞凋亡以及细胞因子的转录等多种细胞反应。无论是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR) 1还是TNFR2受体通路，TNF-α均能激活NF-κB[12]。在3T3-L1脂肪细胞中，TNF-α影响许多前脂肪细胞基因和脂肪细胞基因的转录，抑制NF-κB活化后，大部分TNF-α所抑制的基因( > 98%)以及TNF-α所上调的基因(60 ～ 70%)的转录均有所恢复，可见NF-κB是TNF-α诱导的脂肪细胞基因的转录的重要中间环节[3]。我们的研究显示TNF-α能显著激活3T3-L1脂肪细胞的NF-κB，并伴随GLUT4表达下调。抑制NF-κB活化后GLUT4表达进一步下降，提示TNF-α可能不是通过激活NF-κB而使GLUT4的表达下调。

　　如上所述，TNF-α存在着复杂的信号传导通路，除NF-κB外，TNF-α还可能通过p38 MAPK、p42/p44 MAPK、JNK、PKC以及κB 抑制蛋白激酶(IκB kinase， IKK)等信号通路导致抑制胰岛素受体(insulin receptor， InsR)、IRS-1和IRS-2的胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化，从而影响GLUT4表达[13]。

　　总之，本文的结果显示TNF-α激活3T3-L1脂肪细胞的NF-κB，TNF-α下调GLUT4表达，抑制NF-κB活性后对GLUT4表达进一步下调。这提示了TNF-α可能不是通过激活NF-κB而使GLUT4的表达下调。

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