汉族人群脂联素基因+712A/G和+349A/G多态性与2型糖尿病的关联性研究

　　作者：兰彩莲,张思仲,刘合焜,王西珍,张炜　　作者单位：福建医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学系神经生物学研究中心，福建 福州

　　【摘要】目的 探讨中国四川地区汉族人群脂联素基因(APM1)单核苷酸多态性(SNP)和2型糖尿病(T2DM)及其血脂水平的关联性。方法 研究对象819例，包括对照组405例，T2DM组414例。测定血脂水平和腰臀比值(WHR);稳态模型(HOMA)计算胰岛素抵抗(IR)指数。PCRRFLP和基因测序方法鉴定2号内含子(IVS2)+712A/G和+349A/G多态性。结果 APM1基因IVS2+712A/G位点GG基因型与(AA+AG)基因型在对照组与T2DM组内的分布差异有统计学意义(P<0.05)，T2DM组内GG基因型患者血浆总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)值均高于(AA+AG)基因型(P<0.05);IVS2+349A/G位点各基因型及等位基因频率在对照组与T2DM组内的分布差异无统计学意义(P>0.05)，两组内各基因型间血脂水平差异无统计学意义(P>0.05);IVS2+712A/G与IVS2+349A/G存在强的连锁不平衡(D′=0.893)。结论 APM1基因IVS2+712A/G位点GG基因型与T2DM及其血浆TC和LDL水平升高关联，A→G多态性提高了T2DM合并血脂代谢紊乱的风险性;IVS2+349A/G与+712A/G紧密连锁。

　　【关键词】 脂联素基因,单核苷酸多态性,2型糖尿病;血脂

　　【Abstract】Objective To investigate the association of adiponectin gene (APM1) polymorphism with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and serum lipid levels.Methods APM1 gene IVS2 +712A/G and IVS2 +349A/G polymorphisms were identified by means of PCRRFLP among 819 subjects, including 414 T2DM cases and 405 controls. Serum lipid levels were detected, the waisttohip ratios (WHR) were calculated and the homeostasis model assessment (HOMA) was used to measure insulin resistance(IR). Data were analyzed with SPSS13.0 software. Results The distribution frequencies of the alleles and genotypes were in agreement with the Hardy Weinberg equilibrium. No significantly different was found in allele frequencies and genotype distributions of APM1 gene IVS2 +712A/G polymorphism between T2DM patients and control subjects (P>0.05). However, compared with GG genotype, the distribution of AA + AG genotype was significantly different between T2DM patients and control subjects (χ2=4.416，P<0.05，OR =1.445，95%CI=1.024～2.038). Patients with GG genotypes had higher levels of TC and LDLC (F1=8.400，P1=0.004;F2=8.486，P2=0.004) than patients with AA+AG genotype. No significant difference was found in allele frequencies and genotype distributions of APM1 gene IVS2 +349A/G polymorphism between T2DM patients and control subjects (P>0.05). Further study on serum lipid levels indicated that there were no significant differences in different genotypes in each group. APM1 gene IVS2 +712A/G and IVS2 +349A/G polymorphisms were displayed strong linkage disequilibrium (D′=0.893). Conclusions The GG genotype of APM1 gene IVS2 +712 site may be associated with the occurrence of T2DM and increase the genetic risk of developing T2DM together with lipids disorder. APM1 gene IVS2 +349A/G polymorphism is not associated with T2DM but tightly linked with IVS2 +712A/G.

　　【Key words】Adiponectin gene; Single nucleotide polymorphism(SNP); Type 2 diabetes mellitus; Serum lipid

　　糖尿病是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，大多数为2型糖尿病(T2DM)，有较强的遗传易感性，是经典的多基因型与环境因素协同导致的临床综合征。通过单核苷酸多态性(SNPs)与单体型信息揭示相关遗传因素使人们对其发病机制、诊断及治疗产生全新认识。现已证实，染色体3q27区域存在T2DM和胰岛素抵抗/代谢综合征的易感位点，该区域内人类脂联素基因(APM1,OMIM编号为605441)编码脂联素，调控人机体糖和脂肪代谢，其分泌失衡与代谢相关疾病如糖尿病、肥胖和冠状动脉粥样硬化等密切相关〔1〕。APM1基因的多态性已经成为近年来研究T2DM遗传易感性的重要方向，在高加索人群和局部非高加索人种的大规模研究发现，APM1基因存在相当数量SNPs，其中+45T/G、+276G/T等位点与T2DM的临床表型及其脂代谢异常密切相关〔2～5〕，所以APM1遗传变异，尤其是基因多态性关联分析成为糖尿病研究领域的热点。目前，中国人群中的两个关键性SNPs(IVS2+349A/G和IVS2+712A/G)多态性未见研究报道。本研究将基于中国汉族人群的遗传背景，通过大样本研究探讨上述两个多态性位点与T2DM及其血脂水平的关联性，以期探索参与T2DM发病的遗传学因素。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　研究对象819例，分为2组。(1)T2DM组：选择2002年9月至2006年7月四川大学华西医院内分泌科住院部无血缘关系的T2DM患者414例。其中男270例，女144例，平均年龄(59.17±11.95)岁，均符合1999年中华医学会糖尿病学会制订的T2DM诊断标准，均为汉族。(2)对照组：同期无血缘关系的四川汉族健康个体405例，主要来自四川地区华西医院的体检者。其中男264例，女141例，平均年龄(58.85±9.00)岁，经询问病史、体检、心电图及胸部X线摄片等检查排除心血管疾病、糖尿病等病史及其家族史。以上两组资料进行了种族、地域、年龄构成、性别比例的匹配，并排除了服用降脂药物的病例，两组血脂水平差异有统计学意义。本研究符合四川大学华西医院伦理委员会规定，研究对象均取得知情同意。

　　1.2 方法

　　1.2.1 血脂检测、胰岛素抵抗(IR)指数、腰臀比值(WHR)计算

　　所有研究对象均禁食12 h后取外周血5 ml测定血脂水平。Olympus 5400全自动生化分析仪和罗氏公司试剂测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDLC)。葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FPG)，放射免疫法测定空腹血胰岛素(FINS)，稳态模型评估法(HOMA)计算胰岛素抵抗指数(HOMAIR=FPG×FINS/22.5)(取自然对数值使其符合正态分布)。根据受试者腰围臀围计算WHR(WHR=腰围/臀围)。

　　1.2.2 DNA提取

　　取外周血5 ml，ACD抗凝，盐析法抽提DNA。

　　1.2.3 聚合酶链反应(PCR)

　　软件Primer 5.0设计引物，上海生工生物工程技术有限公司合成。(1)扩增含APM1基因IVS2+712A/G的217 bp片段，正向引物1：5′TGGCATTCAACCACATTTAC3′，反向引物1：5′AAGCCTTCATTCTTCATCAG3′。扩增反应在热循环仪Gene Amp 9600上进行，94℃预变性5 min，95℃变性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min。(2)扩增含APM1基因IVS2+349A/G的292 bp片段，正向引物2：5′GGTGAGAAGGGTGAGAAAGGAG3′，反向引物2：5′TACTGGGAATAGGGATGAGGGT3′，扩增参数同前(退火温度为55℃)。

　　1.2.4 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析和基因测序

　　PCR产物分别进行限制性核酸内切酶消化，反应总体积15 μl，其中含PCR产物10 μl，内切酶Eco81I 1 U(或Rsal 2U)，10×Buffer 1.5 μl(Takara公司)，37℃孵育16 h使样品完全酶切。酶切产物以3%琼脂糖凝胶电泳鉴定分型。PCR扩增产物纯化后,送上海生工生物工程技术有限公司测序证实单核苷酸多态类型。

　　1.3 统计学分析

　　基因型和等位基因频率用基因计数法统计。基因型的HardyWeinberg平衡符合程度用HWE软件作χ2检验，单个基因型及组间等位基因频率比较采用χ2检验。基因型与血脂水平、WHR、IR指数的比较用ANOVA单因素方差分析。应用SPSS13.0统计软件进行处理，采用双侧概率检验。连锁不平衡及单体型分析采用SHEsis在线软件进行统计分析。

　　2 结果

　　2.1 APM1基因多态性分布

　　经HardyWeinberg遗传平衡定律检验，所有基因型在对照组和T2DM组中均符合遗传平衡，具有群体代表性(IVS2+712A/G：对照组χ2=3.371，P=0.066;T2DM组χ2=1.205，P=0.272。IVS2+349A/G：对照组χ2=1.055，P=0.304;T2DM组χ2=0.0005，P=0.982)。两个多态性位点的基因型鉴定分型结果如图1、图2所示。

　　2.2 基因型频率比较及连锁不平衡分析

　　APM1基因IVS2+712A/G位点 AA+AG基因型(A位点携带者)与GG基因型在对照组与T2DM组间差异有统计学意义(P<0.05);APM1基因IVS2+349A/G位点各等位基因和基因型分布频率差异无统计学意义(P>0.05)。

　　IVS2+712A/G与+349A/G经连锁不平衡检验，D′=0893，r=0.235，提示连锁不平衡，但两位点等位基因4种单体型组合未提示存在统计学差异(均P>0.05)。

　　2.3 基因型间血脂水平、WHR、HOMAIR比较

　　(1)APM1基因IVS2+712A/G在对照组内，各基因型间TG、TC、HDLC、LDLC的差异无统计学意义(均P>0.05)，在T2DM组内，(AA+AG)基因型患者的TC和LDLC水平均较纯合子GG基因型显著降低(F1=8.400，P1=0.004;F2=8.486，P2=0.004)，其余血脂水平、WHR及HOMAIR分布差异基因型间比较差异无统计学意义(均P>0.05)(表3);(2)APM1基因IVS2+349A/G各基因型间血脂水平、WHR及HOMAIR分布差异在对照组与T2DM组内比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。

　　2.4 不同人种APM1基因多态性位点频率的比较

　　(1)对于IVS2+712A/G位点，中国人、日本人及非洲人优势等位位点为A，高加索人优势等位位点为G。(2)对于IVS2+349A/G位点，中国人与日本人等位位点A频率较相近，低于欧洲和非洲人群。

　　3 讨 论

　　APM1基因，包括3个外显子和2个内含子，通过调控脂联素表达影响机体的代谢平衡，不同SNPs及单体型对血浆脂联素及胰岛素抵抗均有差异性影响，可能在T2DM的诱发、进展及脂质代谢紊乱中起潜在作用〔1，6，7〕。Woo等〔5〕研究证实，启动子区11391至IVS2 +349位点之间的各种单体型组合对脂联素浓度有明显影响。研究〔2，8，9〕结果显示+712A/G与腰围、血压、血脂、血糖、血浆胰岛素水平、HOMAIR等临床指标均有明显相关性，进一步荟萃分析看出，8～13个SNPs研究得出的结论不尽相同。这种差异也表现在不同人种的研究当中，Vasseur〔4〕对法国高加索人的脂联素基因10个SNPs进行研究,各基因型分布频率与日本人群相差颇大。所以，必须完善不同种族间单个SNP与T2DM及其血脂水平关联性分析及其相互评价，也有利于筛选单体型标签SNP(haplotype tag SNP,htSNP)，并进行单体型关联分析。

　　在国内，APM1基因多态性及与T2DM关联研究工作已经得到一定的进展，如最近报道了IVS2+276G/T，+45T/G与T2DM密切相关，但相关研究比较零散，少有多位点协同分析〔7，10〕。为了更全面揭示中国人群该基因多态性特征及其在T2DM的遗传学作用，笔者深入探讨了IVS2+712A/G和IVS2+349A/G多态性分布规律及基因型表型关系，对于IVS2+712A/G位点，GG基因型与T2DM存在关联性，非A等位基因携带者患糖尿病风险与A等位基因携带者相比增加至1.436倍(P=0.036,OR=1.436);进一步的血脂水平关联分析显示，对照组中各项血脂水平在3种基因型中比较差异没有统计学意义(P>0.05)，T2DM组中，TC与LDLC水平在GG基因型比(AA+AG)基因型显著升高(P1=0004，P2=0.004);同样，作为血脂代谢紊乱临床表现型的WHR(脂分布的倾向)与该多态性存在一定程度关联性(P接近0.05)，提示该位点SNP不影响正常人的血脂水平，但可能影响了T2DM患者的血脂代谢，IVS2+712A→G多态性提高了T2DM合并血脂代谢紊乱的风险性。该位点多态性对胰岛素抵抗的影响，两组间差异无统计学意义，这与国外相关研究结果不同，提示该SNP对T2DM的影响可能不是通过胰岛素调控作用实现。对APM1基因IVS2+349A/G位点分析未发现与T2DM存在直接关联。

　　本研究显示IVS2+712A/G位点与IVS2+349A/G位点存在强的连锁不平衡，提示两个位点内部重组率低，不是重组热区，可能与种族进化演变有关，可以作为建立单体型的tag SNP。这两个多态位点位于APM1基因的2号内含子区，属于调控区SNP(pSNPs)，不会引起编码蛋白功能的直接改变，可能影响 mRNA前体的剪接，降低 mRNA的水平，从而影响蛋白表达量。综合中国人群其他SNPs的研究〔7〕，进一步推测这两个位点也可能与外显子功能性多态位点存在连锁，组成单体型直接改变蛋白功能，与T2DM及其血脂代谢紊乱关联。国外研究已证实2号内含子的SNP276与第3外显子上的G90S错义突变间存在强的连锁不平衡〔3〕，但确切调节机制仍在探讨中。所以，基于以上结果，综合目前中国人群APM1基因的SNPs研究数据，进行单体型的关联分析将是挖掘T2DM及其血脂代谢紊乱发病机制的重要方向。

　　本研究还显示，这两个位点多态性存在人种间的分布差异〔2～5〕，以中国人和日本人为代表的非高加索亚洲人种基因频率均相近，但IVS2+712A/G位点非高加索人种优势等位位点为A，高加索人种优势等位位点为G，IVS2+349A/G位点中A等位基因频率低于非洲和高加索人种，这种差异可能归因于种族间的遗传背景和环境因素。

　　综上所述，APM1基因IVS2+712A/G中GG基因型与T2DM及其血脂TC和LDLC水平升高关联，A→G多态性提高了T2DM合并血脂代谢紊乱的风险性，A等位基因可能是糖尿病代谢综合征的保护因素之一，IVS2+349A/G多态性与T2DM无明显关联性，但与IVS2+712A/G呈紧密连锁。

　　【参考文献】

　　1 Kissebah AH,Sonnenberg GE,Myklebust J,et al.Quantitative trait loci on chromosomes 3 and 17 influence phenotypes of the metabolic syndrome〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(26)：1447883.

　　2 Heid IM,Wagner SA,Gohlke H,et al.Genetic architecture of the APM1 gene and its influence on adiponectin plasma levels and parameters of the metabolic syndrome in 1,727 healthy Caucasians〔J〕.Diabetes,2006;55(2)：37584.

　　3 Hara K,Boutin P,Mori Y,et al.Genetic variation in the gene encoding adipnectin is associated with an increased risk of type 2 diabetes in the Japanese population〔J〕.Diabetes,2002;51(2)：53640.

　　4 Vasseur F,Helbecque N,Dina C,et al.Single nucleotide polymorphism haplotypes in the both proximal promoter and exon3 of the APM1 gene modulate adipocytesecreted adiponectin Hormone levels and contribute to the genetic risk for type 2 diabetes in French Cancasians〔J〕.Hum Mol Genet,2002;11(21)：260714.

　　5 Woo JG,Dolan LM,Deka R,et al.Interactions between noncontiguous haplotypes in the adiponectin gene ACDC are associated with plasma adiponectin〔J〕.Diabetes,2006;55(2)：5239.

　　6 Vionnet N,Hani EH,Dupont S,et al.Genomewide search for type 2 diabetessusceptibility genes in French whites：evidence for a novel susceptibility locus for earlyonset diabetes on chromosome 3q27qter and independent replication of a type 2diabetes locus on chromosome 1q21q24〔J〕.Am J Hum Genet,2000;67(6)：147080.

　　7 Ru Y,Ma M,Ma T,et al.Association of SNP276 in adiponectin gene with type 2 diabetes mellitus and insulin sensitivity〔J〕.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2005;22(6)：698701.

　　8 Menzaghi C,Ercolino T,Di Paola R,et al.A haplotype at the adiponectin locus is associated with obesity and other features of the insulin resistance syndrome〔J〕.Diabetes,2006;51(7)：230612.

　　9 Sutton BS,Weinert S,Langefeld CD,et al.Genetic analysis of adiponectin and obesity in Hispanic families：the IRAS Family Study〔J〕.Hum Genet,2005;117(23)：10718.

　　10 Li S,Li L,Li K,et al.Association of adipose most abundant transcript 1 gene (apM1) with type 2 diabetes mellitus in a Chinese population：a metaanalysis of casecontrol studies〔J〕.Clin Endocrinol (Oxf)，2008;68(6)：8859.