建立食蟹猴糖尿病模型的研究

　　作者：徐传磊,陈艳明,徐志勇,卢起,徐勤　　作者单位：1.广州中医药大学基础医学院，广东广州510405;2.高要康达实验动物科技有限公司，广东高要526107;3.广东体育职业技术学院，广东广州510663

　　【摘要】【目的】建立食蟹猴糖尿病模型，并确定诊断标准。【方法】选用雄性食蟹猴8只，随机分为正常对照组和模型组;采用一次性静脉注射链脲佐菌素(STZ，剂量为45mg/kg)法造模，正常对照组一次性静脉注射柠檬酸缓冲液(剂量为45mg/kg);观察造模前后各组猴的摄食量、饮水量、尿量、体质量变化，检测各组尿糖、空腹血糖、糖耐量、甘油三酯、总胆固醇、C肽、谷氨酸脱羧酶抗体(GADAb)的变化，并进行胰腺组织病理学检查。【结果】造模后模型组摄食量、饮水量及尿量显著增加，体质量、C肽含量显著下降(均P<001)，甘油三酯和总胆固醇均无显著变化(P>005);造模后第2周空腹血糖升高，尿糖由阴性变为“++++”;第5周出现糖耐量异常，第7周空腹血糖与正常组比较有显著性差异(P<001)，GADAb阳性;胰腺组织病理检查结果显示模型组胰岛萎缩、纤维化，而正常对照组胰腺组织无病理改变。【结论】成功建立Ⅰ型糖尿病食蟹猴模型。

　　【关键词】 糖尿病,胰腺,病理学;疾病模型，动物;食蟹猴

　　糖尿病动物模型主要有诱发性糖尿病动物模型、转基因糖尿病动物模型、自发性糖尿病动物模型等，目前主要采用链脲佐菌素(STZ)造模，但是造模动物多选用大鼠，较少选用大动物尤其是灵长类[1]。国外有STZ诱导青年恒河猴糖尿病的报道，国内仅有1例报道并且也选用青年恒河猴[2-8]。本实验采用另一种常用灵长类动物——食蟹猴，以STZ化学损伤建立Ⅰ型糖尿病动物模型，现报道如下。

　　1材料与方法

　　11动物及分组食蟹猴8只，均为雄性，体质量分别为913、965、987、992、1023、1035、1065、1123kg。由广东高要康达实验动物科技有限公司提供[合格证号SCXK(粤)2004-2009]，随机分成2组，即模型组和正常对照组。

　　12主要试剂与仪器链脲佐菌素(STZ)为Sigma公司(美国)产品;500g/L葡萄糖注射液由天津药业集团新郑股份有限公司生产，批号:060921;尿糖试纸由桂林中辉科技发展有限公司生产，批号：6C29;测利得超值型血糖仪(厚美德公司);PHS2C精密级数字式酸度计(上海);Ex3600全自动生化仪(英国);TDL5000B型低速冷冻多管离心机(上海);JA2103型电子天平(上海)。

　　13糖尿病模型制作模型组禁食16h后一次性静脉注射STZ(临用前用01mmol/L、pH 42~45柠檬酸缓冲液配成10mg/L浓度)，剂量为45mg/kg;正常对照组禁食16h后一次性静脉注射01mmol/L、pH 42~45柠檬酸缓冲液，剂量为45mg/kg。

　　14检测指标[9-11]造模后7周内每日观察并记录摄食量、饮水量、尿量、精神状况;每3d称量体质量1次。每周检测空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇;第1、4、5周检测糖耐量;第1、7周检测C肽、谷氨酸脱羧酶抗体(GADAb);实验结束后对动物实施安乐死，并取胰腺做组织病理学检测。

　　15统计学方法采用SPSS 115统计软件进行统计分析。

　　2结果

　　21各组造模前后摄食量、饮水量、尿量及体质量变化比较表1结果表明，模型组在造模后均出现了糖尿病的典型症状:摄食量、饮水量、尿量显著增多，体质量显著下降(均P<001)，正常对照组造模前后上述指标无显著变化(P>005)。

　　22各组造模前与造模后7周C肽、甘油三酯、总胆固醇变化比较表2结果表明模型组C肽含量显著下降(P<001)，而甘油三酯和总胆固醇均无显著变化(P>005)。

　　23各组造模前后血糖、糖耐量变化比较表3结果说明模型组造模后第2周空腹血糖升高，第7周空腹血糖显著上升(P<001)，造模后第5周出现糖耐量异常。

　　24各组造模前后尿糖、GADAb变化比较表4结果说明模型组造模后尿糖变为强阳性，GADAb造模后变为阳性。

　　25各组胰腺组织病理学检查结果图1结果显示模型组胰岛萎缩、纤维化，正常对照组胰腺组织无变化。表1各组造模前与造模后7周摄食量、饮水量、尿量及体质量变化比较

　　3讨论

　　31所造模型相对于以往模型的优势国内研究显示通过给7只青年恒河猴静脉注射不同剂量的链脲佐菌素(30、45、60mg/kg)，实验组的7只猴在给药1月后摄食量、饮水量、排尿量才明显增加，低、中剂量组在96h后才成模，高剂量组虽然较早成模,但该组猴逐渐出现行动困难，反应迟钝，视力下降，面部浮肿，食欲降低，嗜睡等严重症状。虽然给予动物胰岛素皮下注射50U/d，终于在成模后176d死亡 [2-5]。本研究给4只食蟹猴静脉注射STZ 45mg/kg，早在给药后第4周就出现了摄食量、饮水量、排尿量的明显增加，给药后第2天即发现动物尿糖阳性，第3天的空腹血糖浓度开始呈持续性升高。

　　32糖耐量时间点的选择从猴糖耐量检测时间点看，彭芳等[9]在借助糖耐量从猕猴中筛选自发性糖尿病动物模型时，仅选择了0、90min 2个时间点，未能反映动物血糖下降的趋势。蒋绿芝等[3]利用链脲佐菌素诱导恒河猴糖尿病动物模型，检测糖耐量时选择了0、5、10、20、30、60、90min，漏掉了120min这一重要的时间点，而120min血糖在人类糖尿病诊断标准中是一个重要的指标。本研究的糖耐量检测选择了时间点0、30、60、90、120min检测糖耐量，反映了血糖下降趋势，并记录了重要的120min血糖值，综合了以上两种时间点选择的优势。

　　33猴糖尿病诊断标准的制订根据流行病学调查，GAD是最早出现的自身抗原，在新诊断的Ⅰ型糖尿病病人中，60%～80%可检出GAD抗体，高者达96%[10-11]。长期以来，动物糖尿病的血糖标准各文献报道不一致，多为111~167mmol/L之间，尚未见关于食蟹猴糖尿病诊断标准的相关报道。王济等[12]建立中国地鼠自发性遗传性糖尿病，若3次或3次以上非空腹血糖均>67mmol/L确定为糖尿病地鼠。陈晓丽等[13]用四氧嘧啶注射Wistar大鼠造模，隔夜禁食12h，测尾静脉血糖>78mmol/L确定为糖尿病。李晶等[14]用四氧嘧啶诱发大白兔糖尿病模型，以注射后48、72h血糖值>100mmol/L确定为糖尿病。戴自英等[15]认为糖尿病模型血糖值标准为:连续2d血糖值超过111mmol/L或葡萄糖耐量实验时，120min血糖仍未恢复到注射前水平。贾雪梅等[16]的研究报道，小鼠血糖升高至145~278 mmol/L，高血糖状态持续3周以上者确定为糖尿病小鼠模型。本实验结果显示，在空腹血糖维持在高水平的同时，糖尿病的典型症状摄食、饮水和尿量增加即“三多”均表现很明显，尿糖也一直维持“++++”的水平，静脉糖耐量实验中2h 空腹血糖≥100mmol/L。故在制订食蟹猴糖尿病诊断标准的时候，空腹血糖是一个重要的参考指标，同时通过对人类糖尿病诊断标准的研究，糖耐量也是一个重要的指标。经抽样调查，食蟹猴正常空腹血糖为(510士189)mmol/L。综上所述，参照猴正常空腹血糖，可以判定动物已成模，且猴糖尿病的诊断标准为：①空腹血糖≥80mmol/L且持续3周以上(空腹指至少8h未进食);②葡萄糖耐量试验中，葡萄糖负荷后2h血糖≥100mmol/L。具有以上2条之一皆可视为动物已患有糖尿病，若动物C肽下降(检测C肽水平能准确反映出胰岛β细胞的分泌功能[17])、GADAb变为阳性，则可认为此糖尿病为Ⅰ型。当然，本试验中也暴露出一些问题，在此提出以下解决办法：①在给动物注射STZ后48h内每4h检测1次血糖，如发现有异常即视情况注射胰岛素或葡萄糖;②作为判断动物成模的重要指标，血糖和尿糖的关系以及何时出现异常尚未明确，所以建议在今后的试验中增加检测时间点，在给药后第2天即每日检测尿糖，如果出现异常即予当天晚上禁食，并于次日检测空腹血糖，而且还要在接下来的2周内每3d平行检测尿糖和空腹血糖1次;③结合猴的特殊糖代谢特点，糖耐量实验应改为检测以下几个时间点的血糖值：0、10、30、60、120min;④动物在实验结束之后将不处死，观察糖尿病并发症的出现种类以及出现时间。

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