糖尿病患者外周血树突细胞功能活性检查及抑制NFκB活性的意义

　　作者：张洪德,胡劲辉,柳忠辉　　作者单位：广东省深圳市龙岗中心医院，广东 深圳

　　【摘要】目的 检测糖尿病(DM)患者外周血单个核细胞(PBMNCs)培养树突细胞(DC)的功能表达及其临床意义, 探讨DC成熟过程中核因子 (NF) κB基因的作用。方法 DM患者及健康成人PBMC体外经GMCSF和IL4诱导培养DC,在DC培养中加入NFκB特异性低脱氧核苷酸(ODN)阻断NFκB 活性,检测细胞表面分子表达以及混合淋巴细胞反应(MLR)检测其功能变化。结果 DM患者外周血培养获成熟DC数量较多,DC表面标志较正常对照表达升高, 具有较强的激发MLR的能力,DC成熟高于正常人。但NFκB ODN可以抑制DC表面标志的表达,阻碍DC发育成熟, 降低激发MLR的能力，并不可被脂多糖(LPS) 所逆转。结论 DM患者DC免疫功能高于正常对照DC功能状态，NFκB是DC发育成熟过程中关键性调控基因。应用NFκB ODN可抑制DC成熟,诱导生成耐受原性未成熟DC。

　　【关键词】 树突细胞; 核因子κB; 寡核苷酸探针; 糖尿病

　　研究表明糖尿病(DM)患者树突细胞(DC)表面分子表达较正常对照相显著增强，DC成熟增多。在DC 的成熟信号传导通路中,核因子 (NF)κB 起着决定性作用〔1〕。DC作为功能强大的抗原递呈细胞, 不但具有免疫激活作用,而且在一定的成熟状态下可诱导免疫耐受。DC的免疫调节作用与其发育成熟状态密切相关〔2〕。目前,有关DC和DM的具体机制尚未明确，DM发生发展过程极其复杂,尤其是在人体内遗传、炎症等多因素使其发生更加微妙。本研究分析培养获得DC免疫分子表达及混合淋巴细胞反应(MLR)能力特点,分析DC功能状态,加入新的反义基因技术制备的NFκB特异性低脱氧核苷酸(ODN),阻断NFκB 的活性〔3〕,抑制DC的发育成熟,诱导具有耐受原性的未成熟DC，并采取脂多糖(LPS)改良培养措施检测能否逆转ODN对NFκB的抑制作用，以期为临床以DC为基础的DM生物治疗提供一定实验基础和理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 依据DM患者的诊断标准〔4〕，抽取20名未经药物治疗的DM患者外周血，其中男12例,女8例,年龄32～70(平均51.0±10.2)岁。对照组外周血标本源于均为无DM病史及家族史的健康志愿献血者10名，其中男7例，女3例，年龄21～50(平均35.5±10.3)岁，两组年龄及性别构成比无显著差异，具可比性。

　　1.2 主要试剂 rhGMCSF和IL4 购自美国R&D公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)及淋巴细胞分离液购自Sigma公司;培养液RPMI1640和胎牛血清购自美国Gibco公司;单克隆抗体CD80、CD83和CD86 购自美国BD公司;NFκB特异性低脱氧核苷酸(ODN)由上海生物制品研究所提供的单链(正义序列为5′AGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCC3′)的ODN。

　　1.3 外周血DC的培养和计数 人外周血单核细胞(PBMNCs)源DC的培养见文献〔5,6〕。收获细胞悬液计量后取100 μl，采用定量流式细胞术对获得DC中成熟DC进行计数，以流量200 μl为限,对照调零后检测CD83+ 细胞含量, 并推算原细胞悬液中CD83+DC总量。

　　1.4 DC表型分析 正常对照组和DM组于第5天分离培养DC; ODN 处理组于培养开始时加入10 μmol/L NFκB ODN 共同孵育; LPS 刺激组于培养开始时加入10 μmol/L NFκB ODN,于培养结束前18 h 加入外源性LPS(150 ng/ml) 刺激。用FITC或PE标记 CD80、CD86、CD40 等单克隆抗体,采用直接或间接免疫荧光法,流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测各组DC的表面分子表达。

　　1.5 MLR 取同种异体的健康人外周血,淋巴细胞分离液处理获得PBMNCs,贴壁法获得同种异体淋巴细胞(反应T细胞)。取96孔培养板分别加入反应T细胞3×105/100 μl和收集各组培养后的DC(刺激细胞), 37℃、5%CO2条件下培养5 d 后,每孔加MTT 15 μl (5 μg/ml) ,再培养4 h。弃上清加入异丙醇终止反应。在酶标仪上550 nm 处测OD 值。

　　1.6 统计学处理 数据以x±s表示,采用SPSS13.0 统计软件进行方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 DM组及正常对照组DC形态、数量 从外周血获取的PBMNCs，加入GMCSF、IL4培养2 d后,可见贴壁细胞聚集成散在的细胞集落,每个集落有约10～20个细胞,并出现少量的悬浮细胞，培养7 d后大部分细胞呈悬浮状,细胞体积大且形态不规则,出现许多短的毛刺状突起，与健康成人DC无明显差异。流式细胞术定量分析结果显示正常成人外周血40 ml DC 中CD83+DC数量〔(5.4±2.5)×106〕明显低于DM患者〔(9.7±2.5)×106〕(P<0.01)。

　　2.2 DM组及正常对照组DC表面分子表达 FACS 检测DC表面分子发现, DM组DC上CD86、CD80 及CD83 均显著高于正常对照组(P<0.05)。ODN 处理组DC表面分子表达较正常对照组无明显差别,经LPS 刺激后(LPSODN),其表面分子的表达也没有明显变化，可见NFκB ODN 可抑制DC表面分子的表达，并且这种抑制作用不可被LPS所逆转。

　　2.3 MLR变化 与正常对照组OD值(0.58±0.16)相比,ODN 处理组(0.63±0.11)和LPSODN 组(0.68±0.09)DC 抑制同种混合T 淋巴细胞反应，诱导了同种T淋巴细胞低反应性(P<0.05)，与DM组(1.26±0.08)比尤其明显(P<0.01)。同种异体混合淋巴细胞反应表明,经过细胞因子GMCSF、IL4 诱导获得的DC具有极强的刺激T细胞增殖的能力,而在加入NFκB ODN 处理后的DC则刺激T细胞增殖能力较低，经LPS 刺激(LPSODNDC)后并没有明显改变。

　　3 讨 论

　　DC是唯一能激活未致敏的T淋巴细胞, 启动初次免疫应答的抗原递呈细胞(APC),在调节先天性和获得性免疫反应中起关键作用。近来越来越多的证据表明,DC 在诱导免疫耐受中起重要作用〔7〕。DC驾御免疫反应的方向和程度,目前认为与其所处的成熟状态有关〔8〕。未成熟DC 因表面共刺激分子的低表达而诱导T 淋巴细胞的低反应性或无能(anergy) ;而成熟DC则可刺激T 细胞的免疫反应性。NFκB 是一种转录因子,通过调节细胞因子、趋化因子以及免疫受体等基因的转录,在免疫反应中起重要作用〔9〕 。NFκB同样存在DC 细胞内, 在调节DC 的发育、生存以及细胞因子分泌等方面都起重要作用。 NFκB ODN 利用新的反义技术,通过和转录因子特异性一致的序列,竞争性与靶基因启动区结合,从而削弱甚至阻断转录因子调节靶基因表达的功能〔10〕 。越来越多的研究〔11〕显示NFκB与DM的病理生理机制密切相关, 目前已证实高血糖和氧化应激的主要靶细胞是转录因子NFκB ,并通过其调控与炎症、细胞增生、细胞分化等密切相关的多种基因表达, 更多研究正逐步揭示DM、炎症和各种炎症因子之间存在必然联系。

　　DM病因及机制十分复杂,而慢性炎症只是其中重要因素之一,NFκB 与DM发生和发展密切相关。因此,进一步研究NFκB 基因多态性与DM易感性之间的关系及应用作用于NFκB 信号转导通路各环节的抑制剂以阻断NFκB 信号转导通路激活的有关因子的表达,可能会对DM胰岛β细胞产生保护作用,并且可以改善DM胰岛素抵抗(IR)。

　　本实验应用ODN与NFκB 特异性结合,进而抑制NFκB核转移,阻断NFκB 激活靶基因转录活性。FACS 检测DC表面分子发现,DM患者组DC上CD86、CD80 及CD83 均显著高于正常对照组。ODN 处理组DC表面分子表达较健康对照组无明显差别,经LPS 刺激后(LPSODNDC),其表面分子的表达无明显变化，可见NFκB ODN 可抑制DC 表面分子的表达，并且这种抑制作用不可被LPS 所逆转。另外,MLR 结果也发现,NFκB ODN 处理的DC 明显抑制了T 细胞的增殖反应活性。ODN 处理组DC 抑制同种混合T 淋巴细胞反应，与其他各组相比, ODNDC 诱导了同种T 淋巴细胞低反应性(P<0.05)，与DM组比尤其明显(P<0.01)。同种异体混合淋巴细胞反应表明,经过细胞因子GMCSF、IL4 诱导获得的DC具有极强的刺激T 细胞增殖的能力,而在加入NFκB ODN 处理后的DC则刺激T 细胞增殖能力较低，经LPS 刺激后(LPSODNDC)并没有明显改变。目前临床上所应用的免疫抑制剂泼尼松、环孢素A(CsA) 、霉酚酸脂(MMF) 、他克莫司( FK506) 、西罗莫司(Rapamycin) 等,在体外或多或少都有抑制DC成熟的作用,但这些非特异性免疫抑制剂毒性大,抑制DC 成熟的作用弱且不完全,并且很容易被细胞因子所逆转〔12,13〕 ，所以NFκB ODN 与其他抑制DC 成熟的策略相比有明显优势。实验结果提示,NFκB ODN 对DC成熟的抑制作用具有持续的、不可逆转的效应。因此,采用NFκB ODN 抑制DC成熟、诱导产生耐受原性DC 的方法,比免疫抑制剂等方法更有效、更安全。由于本研究为体外单一因素离体研究,主要从免疫炎症和调节出发,难免存在局限性。随着DC与DM关系的研究不断深入,将会为DM发生机制和防治提供新思路。

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